培養(yǎng)基的制備和滅菌

第三節(jié)

培養(yǎng)基的制備和滅菌培養(yǎng)基（medium，復(fù)數(shù)media；或culturemedium）

是指由人工配制的、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合營養(yǎng)料。任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素，其間的比例是合適的？碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因子、水link1絕大多數(shù)微生物都可在人工培養(yǎng)基上生長，只有少數(shù)難養(yǎng)菌（fastidiousmicroorganisms）至今無法在人工培養(yǎng)基上生長。難養(yǎng)菌是指寄生或共生的微生物，例如.類支原體（MLO）、類立克次氏體（RLO）和少數(shù)寄生真菌等。

（一）配制培養(yǎng)基的4個原則

1.目的明確

2.營養(yǎng)協(xié)調(diào)

3.理化適宜

4.經(jīng)濟(jì)節(jié)約

一、選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則和方法1.目的明確培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB（溶菌肉湯）培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；

根據(jù)不同的工作目的，微生物不同的營養(yǎng)需要，運(yùn)用自己豐富的生物化學(xué)和微生物學(xué)知識來配制最佳的培養(yǎng)基。

對微生物細(xì)胞組成元素的調(diào)查或分析，是設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時的重要參考依據(jù)。2.營養(yǎng)協(xié)調(diào)（1）調(diào)查和分析微生物細(xì)胞組成微生物細(xì)胞內(nèi)各種成分間有一較穩(wěn)定的比例。在大多數(shù)化能異養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中，各營養(yǎng)要素間在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)律：要素：含量：H2O＞(～10-1)C源+能源＞

(～10-2)N源＞(～10-3)K、Mg＞(～10-5)P、S＞(～10-4)生長因子(～10-6)實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；（2）選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)1）根據(jù)培養(yǎng)微生物的種類選擇相適應(yīng)的培養(yǎng)基2）根據(jù)培養(yǎng)微生物的種類選擇相適應(yīng)的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室一般培養(yǎng)：普通常用培養(yǎng)基；遺傳研究：成分清楚的合成培養(yǎng)基；生理、代謝研究：選用相應(yīng)的培養(yǎng)基配方；營養(yǎng)物質(zhì)的濃度適宜；營養(yǎng)物質(zhì)之間的配比適宜；高濃度糖類物質(zhì)、無機(jī)鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進(jìn)微生物的生長，反而起到抑制或殺菌作用。（3）營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（C／N）的影響較大。link2發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時：碳氮比為4/1時，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少；碳氮比為3/1時，菌體繁殖受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。真菌需C／N比較高的培養(yǎng)基；（素食）細(xì)菌（動物病原菌）需C／N比較低的培養(yǎng)基；（葷食）NH3＞CO(NH2)2＞NH4NO3＞(NH4)2CO3＞(NH4)2SO4含氮量（82％）（46％）（35％）（29.2％）（21％）在同樣重量時，在以上各氮源中含氮量以氨為最高，尿素次之，硝酸銨和碳酸銨更次之，而硫酸銨則最低。3.理化適宜指培養(yǎng)基的pH值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢等物理化學(xué)條件較為適宜。pH滲透壓和水活度氧化還原電位（1）pH各大類微生物都有其生長適宜的pH范圍，培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。細(xì)菌：pH7.0~8.0放線菌：pH7.5~8.5酵母菌：pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~5.8藻類：pH6.0~7.0原生動物：pH6.0~8.0嗜極菌（extremophiles）初始pH通常培養(yǎng)條件：在微生物的生長、代謝過程中會產(chǎn)生引起培養(yǎng)基pH改變的代謝產(chǎn)物，為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常要進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)pH的外源調(diào)節(jié)pH的調(diào)節(jié)（2）滲透壓和水活度它表示兩種濃度不同的溶液間被一個半透性薄膜隔開時，稀溶液中的水分子會因水勢（waterpotentiality）的推動而透過隔膜流向濃溶液，直到濃溶液產(chǎn)生的機(jī)械壓力足以使兩邊水分子的進(jìn)出達(dá)到平衡為止，這時由濃溶液中的溶質(zhì)所產(chǎn)生的機(jī)械壓力，即為它的滲透壓值。

滲透壓（osmoticpressure）是某水溶液中一個可用壓力來量度的一個物化指標(biāo)。與微生物細(xì)胞滲透壓相等的等滲溶液最適宜微生物的生長；高滲溶液會使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離；低滲溶液則會使細(xì)胞吸水膨脹，形成很高的膨壓，這對細(xì)胞壁脆弱或喪失的各種缺壁細(xì)胞，例如原生質(zhì)體、球狀體或支原體來說，則是致命的。是一個比滲透壓更有生理意義的一個物化指標(biāo)。它表示在天然或人為環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量。水活度的定量涵義水活度即aw（wateractivity）（3）氧化還原電勢（redoxpotential）又稱氧化還原電位，是度量某氧化還原系統(tǒng)中還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標(biāo)。一般以Eh表示，它是指以氫電極為標(biāo)準(zhǔn)時某氧化還原系統(tǒng)的電極電位值，單位是V（伏）或mV（毫伏）。不同類型微生物生長對氧化還原電位的要求不同好氧性微生物：+0.1伏以上時可正常生長，以+0.3～+0.4伏為宜；厭氧性微生物：低于+0.1伏條件下生長；兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時進(jìn)行好氧呼吸，

+0.1伏以下時進(jìn)行發(fā)酵。氧化還原電位與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓，或加入氧化劑，從而增加Eh值；在培養(yǎng)基中加入巰基乙醇、抗壞血酸（Vc，0.1%）、硫化氫(0.025%)、半胱氨酸（<0.05%）、谷胱甘肽、鐵屑、二硫蘇糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等還原性物質(zhì)可降低Eh值。測定氧化還原電勢除用電位計(jì)外，還可在培養(yǎng)基中加入化學(xué)指示劑刃天青（resazurin）進(jìn)行間接測定。在無氧條件下呈無色（Eh＝-40mV）；在有氧條件下，其顏色與溶液的pH相關(guān)；（中性——紫色；堿性——藍(lán)色；酸性——紅色）在微量氧時，它呈粉紅色。刃天青（4）培養(yǎng)基的滅菌處理要獲得微生物純培養(yǎng)，必須避免雜菌污染，因此對所用器材及工作場所進(jìn)行消毒與滅菌。對培養(yǎng)基而言，更是要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌。對培養(yǎng)基一般采取高壓蒸汽滅菌，一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm,121.3℃條件下維持15～30min可達(dá)到滅菌目的。在高壓蒸汽滅菌過程中，長時間高溫會使某些不耐熱物質(zhì)遭到破壞，如使糖類物質(zhì)形成氨基糖、焦糖，因此含糖培養(yǎng)基常在0.56kg/cm，112.6℃15～30min進(jìn)行滅菌，某些對糖類要求較高的培養(yǎng)基，可先將糖進(jìn)行過濾除菌或間歇滅菌，再與其他已滅菌的成分混合；

長時間高溫還會引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子（特別是鈣、鎂、鐵離子）結(jié)合形成難溶性復(fù)合物而產(chǎn)生沉淀，因此，在配制用于觀察和定量測定微生物生長狀況的合成培養(yǎng)基時，常需在培養(yǎng)基中加入少量螯合劑，避免培養(yǎng)基中產(chǎn)生沉淀，常用的螯合劑為乙二胺四乙酸（EDTA）。4.經(jīng)濟(jì)節(jié)約配制培養(yǎng)基時應(yīng)盡量利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成份,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,以降低生產(chǎn)成本。（1）以粗代精（2）以“野”代“家”（3）以廢代好（4）以簡代繁（5）以氮代朊（6）以纖代糖（7）以烴代糧（8）以“土”代“洋”以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉質(zhì)的野生植物，可以部分取代糧食用于工業(yè)發(fā)酵的碳源。（1）以粗代精對微生物來說，各種粗原料營養(yǎng)更加完全，效果更好。而且在經(jīng)濟(jì)上也節(jié)約。大量的農(nóng)副產(chǎn)品或制品，如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白胨等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料（2）以“野”代“家”以工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中易污染環(huán)境的廢棄物作為培養(yǎng)微生物的原料。例如，糖蜜(制糖工業(yè)中含有蔗糖的廢液)、乳清(乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液)、豆制品工業(yè)廢液、黑廢液(造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等。工業(yè)上的甲烷發(fā)酵主要利用廢水、廢渣作原料,在我國農(nóng)村，已推廣利用糞便及禾草為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲烷作為燃料。（3）以廢代好（4）以簡代繁減少營養(yǎng)物質(zhì)也許會帶來意想不到的效果。某制藥廠改進(jìn)鏈霉素發(fā)酵液中的原有配方，設(shè)法減去30-50%的黃豆餅粉、25%的葡萄糖和20%硫酸銨，結(jié)果反而提高了產(chǎn)量。（5）以氮代朊以大氣氮、銨鹽、硝酸鹽或尿素等一類非蛋白質(zhì)或非氨基酸廉價原料用作發(fā)酵培養(yǎng)基的原料，讓微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白質(zhì)或含氮的發(fā)酵產(chǎn)物供人們利用。（6）以纖代糖開發(fā)利用纖維素這種世界上含量最豐富的可再生資源。將大量的纖維素農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)質(zhì)飼料、工業(yè)發(fā)酵原料、燃料及人類的食品及飲料。（7）以烴代糧，以糧代烴以石油或天然氣副產(chǎn)品代替糖質(zhì)原料來培養(yǎng)微生物。生產(chǎn)石油蛋白；將石油產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成一些產(chǎn)值更高的高級醇、脂肪酸、環(huán)烷酸等化工產(chǎn)品和若干合成物；對石油產(chǎn)品的品質(zhì)進(jìn)行改良，如脫硫、脫蠟等；用糖類生產(chǎn)烴類化合物。（8）以“土”代“洋”以國產(chǎn)原料代替進(jìn)口原料，盡量減少工業(yè)成本。國內(nèi)青霉素發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展，依賴于找到了富有中國特色的培養(yǎng)基配方，即用廉價的棉子餅（或花生餅）和白玉米粉代替玉米漿和乳糖。（二）4種方法

1.生態(tài)模擬

直接取用這類天然基質(zhì)（經(jīng)過滅菌）或模擬這類自然條件，就可獲得一個“初級的”天然培養(yǎng)基來培養(yǎng)相應(yīng)的微生物。例如，用肉湯、魚汁來培養(yǎng)細(xì)菌；用果汁來培養(yǎng)酵母菌；用潤濕的麩皮、米糠培養(yǎng)霉菌；用米飯或面包來培養(yǎng)根霉；用肥土來培養(yǎng)放線菌；用玉米芯來培養(yǎng)脈孢菌（Neurosporaspp.）等。2.參閱文獻(xiàn)（1）直接經(jīng)驗(yàn)（2）查閱、分析和利用一切文獻(xiàn)資料上的對自己直接或間接有關(guān)的信息中國期刊網(wǎng)（全文數(shù)據(jù)庫）萬方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng)維普數(shù)據(jù)庫生物引擎/生物通/生物橋/3.精心設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)新配方各項(xiàng)因素的比較或反復(fù)試驗(yàn)優(yōu)選法或正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法工作量很大4.試驗(yàn)比較試驗(yàn)的規(guī)模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步擴(kuò)大的原則。生態(tài)模擬參閱文獻(xiàn)精心設(shè)計(jì)試驗(yàn)比較設(shè)計(jì)一種優(yōu)化的培養(yǎng)基

例如，先在培養(yǎng)皿瓊脂平板上測試某微生物的營養(yǎng)要求，然后作搖瓶培養(yǎng)（shakeculture）試驗(yàn)，再進(jìn)行臺式發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗(yàn)，最后才擴(kuò)大到試驗(yàn)型發(fā)酵罐和生產(chǎn)型發(fā)酵罐的規(guī)模。二、培養(yǎng)基的配制配料溶解調(diào)pH過濾分裝滅菌包扎擺斜面貯存碳氮比（C／N）比：碳源含量氮源含量碳氮比（C／N比）＝碳源中碳原子的摩爾數(shù)氮源中氮原子的摩爾數(shù)內(nèi)源調(diào)節(jié)主要有以下兩種方法：第一種是采用磷酸緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。①pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)通過培養(yǎng)基內(nèi)在成分所起的調(diào)節(jié)作用，就是pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者濃度比可獲得pH6.0～7.6間的一系列穩(wěn)定的pH。［K2HPO4］［KH2PO4］＝1時，溶液的pH穩(wěn)定在6.8。反應(yīng)原理：K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KClKH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O第二種以CaCO3作“備用堿”進(jìn)行調(diào)節(jié)。

CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培養(yǎng)基中分布不均勻）、NaHCO3均可用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。反應(yīng)是：②pH的外源調(diào)節(jié)這是一類按實(shí)際需要不斷從外界流加酸或堿液，以調(diào)整培養(yǎng)液的方法。水活度某溶液的蒸汽壓純水蒸汽壓aw＝該溶液的百分相對濕度值（ERH，equilibriumrelativehumidity）aw各種微生物生長繁殖范圍的aw值在0.998～0.6之間。back11.配料

在容器中加入少量水按照配方正確稱取各種