生化分離工程-蘇海佳-第三章細胞破碎

微生物的代謝產(chǎn)物多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，氨基酸等目標產(chǎn)物存在于在發(fā)酵液中。有些目標產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的多數(shù)蛋白質(zhì)不會被分泌到發(fā)酵液中，而是在細胞內(nèi)沉積。脂類和一些抗生素也是包含在生物體中。目標產(chǎn)物就是細胞本身，如面包酵母。胞外胞內(nèi)細胞目前一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點目前二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點細胞破碎是指：選用物理、化學、酶或機械的方法來破壞細胞壁或細胞膜。胞外物質(zhì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)酵液預處理——澄清液收集菌體——細胞破碎——轉(zhuǎn)入液相——碎片分離主要劃分為兩大類:化學法和機械法目前三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點3·1細胞壁結(jié)構(gòu)和化學組成目前四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1.細菌的細胞壁所有的細菌細胞壁由堅固的骨架——肽聚糖組成

1、肽聚糖由聚糖鏈借短肽交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細胞有一定的形狀和強度；2、短肽一般由4-5個氨基酸組成，常含有D-氨基酸與二氨基庚二酸；3、聚糖鏈由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通過（1-4）糖苷健連接而成。短肽接在N-胞壁酸上，相鄰的短肽交叉相連，形成網(wǎng)狀。目前五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點目前六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點所有細菌都含有肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚，約15-50nm，肽聚糖含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸；革蘭氏陰性菌的肽聚糖層約，外有一外壁層約8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂構(gòu)成的兩層外壁層。革蘭氏陽性菌的細胞壁比革蘭氏陰性菌堅固，較難破碎。特點：

破碎阻力：肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強度，與肽鍵的數(shù)量和交聯(lián)度有關(guān)。目前七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點Gram-negativeprocaryotes革蘭氏陰性原核生物（E.coli）目前八頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、里層葡聚糖的細纖維——細胞壁的剛性骨架；2、覆蓋在細纖維上的是一層糖蛋白；3、外層是由1，6—磷酸二脂鍵共價連接而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的甘露聚糖；4、其內(nèi)部有甘露聚糖—酶的復合物。2、酵母的細胞壁組成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽性菌的細胞壁厚，更難破碎。例如，面包酵母的細胞壁厚約70nm。特點：破壁阻力：壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和壁厚。目前九頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點植物細胞壁的主要組成成分是纖維素在初生壁上還有半纖維素和果膠質(zhì)纖維素是由鏈狀結(jié)構(gòu)的-D-葡萄糖以1，4-葡萄糖苷鍵結(jié)合，纖維素分子束聚集——微纖絲——植物細胞壁的框架，而其他物質(zhì)填充在微纖絲之間的空隙中——植物細胞壁的基本結(jié)構(gòu)。在干燥植物體中纖維素約占總重的1/3一1/2。目前十頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點就是使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞(增大通透性)或破碎，釋放其中的目標產(chǎn)物。細胞的大小，形狀、聚合物的交聯(lián)程度破碎細胞的目的影響破碎的因素：目前十一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點※

3.2細胞破碎和產(chǎn)物釋放原理目前十二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點利用化學、生化試劑或酶改變細胞壁或細胞膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率，或完全溶解細胞壁，形成原生質(zhì)體，在滲透壓作用下，細胞膜破裂釋放胞內(nèi)物質(zhì)?；瘜W法壓縮力和剪切力——高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎、超聲波破碎機械法主要有：酸堿處理、化學試劑處理、酶溶滲透壓沖擊法和凍結(jié)—融化法物理滲透法目前十三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點細胞破碎機理目前十四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點※

3.3mechanicaldisruption

機械破碎目前十五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、處理量大，破碎快，時間短，效率較高，工業(yè)規(guī)模的重要手段；2、作用力：擠壓，剪切和撞擊作用；3、在許多情況下，細胞內(nèi)含物全部釋放出來；4、由于機械攪拌產(chǎn)生熱量，破碎要采用冷卻措施。機械法破碎特點機械破碎主要的方法有珠磨法、高壓勻漿法、撞擊破碎法和超聲波等方法。目前十六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1.高壓勻漿法（high-pressurehomogenization）原理：利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速撞擊造成細胞破裂，在高壓勻漿器中，細胞經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞和由高壓到常壓的突變，從而造成細胞壁的破壞，細胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物得到釋放。目前十七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點高速勻漿破碎的動力學方程為：細胞破碎率S與操作壓力P和循環(huán)次數(shù)N之間的關(guān)系。k為破碎速度常數(shù)上述參數(shù)隨微生物種類和培養(yǎng)條件的不同而有所差異壓力P可用動能表達：目前十八頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點影響因素：細胞破碎率用包內(nèi)產(chǎn)物釋放率表示：1、壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)，操作壓力影響最大。工業(yè)生產(chǎn)中常采用的壓力為55－70Mpa。2、不同菌種，不同生長期以及不同培養(yǎng)條件。目前十九頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點優(yōu)點：1、操作參數(shù)少，且易于確定；2、樣品損失量少，在間歇處理少量樣品方面效果好3、適用于酵母和大多數(shù)細胞的破碎。適用范圍：1、適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞；2、細胞濃度可達20%；3、團狀或絲狀真菌易造成堵塞，一些易損傷勻漿閥，質(zhì)地堅硬的亞細胞器一般不適用；4、需設置冷卻裝置。目前二十頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點原理：細胞懸浮液與玻璃珠（或石英砂，或氧化鋁）一起高速攪拌，研磨使細胞達到某種程度破碎，2.珠磨法（Beadmilling）作用力：剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動目前二十一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點WSK臥式高效全能珠磨機ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機目前二十二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點兩種情況下，細胞破碎動力學可近似表示為：t：為細胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時間其中V為懸浮液體積m3，Q為懸浮液流量m3/S，S為破碎率，k為破碎速率常數(shù)，與許多因素有關(guān)?？刹捎瞄g歇式與連續(xù)操作。間歇操作：t為破碎操作時間即連續(xù)操作：目前二十三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、隨細胞種類而異；2、同一進料速度，細胞濃度，則破碎率，能耗；3、同一懸浮液中，破碎的能耗與破碎率成正比，提高破碎率，導致電能消耗增加；4、對一定細胞，存在適宜的微球粒徑，通常D/d=30-100，D：微球粒徑；d：目標細胞粒徑。攪拌轉(zhuǎn)速懸浮液進料速率微球大小微球填充密度細胞濃度微球密度溫度攪拌槳設計破碎室的幾何形狀影響目前二十四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、操作簡便穩(wěn)定，破碎率可控制，易放大2、在實驗室和工業(yè)規(guī)模上已得到應用3、適用于絕大多數(shù)微生物細胞破碎，特別對于有大量菌絲體的微生物和一些有亞細胞器（質(zhì)地堅硬）的微生物細胞。缺點：破碎過程產(chǎn)生大量的熱能，有效能量利用率僅為1%，應充分考慮換熱。優(yōu)點：目前二十五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點3、撞擊破碎原理：將細胞冷凍可使其成為剛性球體，降低破碎的難度。如圖：細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成粒徑小于50m的微粒子。高速載氣(如氮氣，流速約300m/s)。將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細胞發(fā)生破碎。目前二十六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、細胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細胞破碎均勻，可避免細胞反復受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象。2、細胞破碎程度可通過無級調(diào)節(jié)載氣壓力(流速)控制，避免細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。3、適用于大多數(shù)微生物細胞和植物細胞的破碎，通常處理細胞懸浮液濃度為10%-20%。4、實驗室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50-500cm3，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理在l0dm3/h以上.特點：目前二十七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點4、超聲波破碎法(Ultrasonication)破碎機理：是與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)，即空穴作用產(chǎn)生的空穴泡由于又受到超聲波的沖擊而閉合，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊力壓力，由此而引起懸浮細胞上產(chǎn)生了剪切應使細胞內(nèi)液體產(chǎn)生流動而使細胞破碎?？栈饔脵C械作用熱效應目前二十八頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、處理少量樣品時操作方便，液體損傷量少，破碎率高。2、有效能量利率極低，操作時需在冰水中進行或通入冷卻劑而增加成本，不易放大；3、適用于大多數(shù)微生物的破碎，不適于大規(guī)模操作，主要用于實驗室規(guī)模的細胞破碎。影響：細胞種類、濃度、處理時間以及超聲波的聲頻特點：目前二十九頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點方法技術(shù)原理效果成本舉例機械法研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴細胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細胞通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中細胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理細胞機械破碎法比較目前三十頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點

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3.4CHEMICALMETHODS

化學方法目前三十一頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1.堿處理利用酸堿調(diào)節(jié)pH值，可提高目標產(chǎn)物溶解度。堿處理20－30min可導致細胞溶解。缺點：pH=11－11.5的堿濃度破壞了許多生物活性，使蛋白酶失活，常伴隨著蛋白的變性和降解。優(yōu)點：價格便宜，易適于任何規(guī)模的操作。目前三十二頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2.化學試劑法化學滲透取決于試劑的類型和細胞壁、細胞膜的結(jié)構(gòu)與形成。1).EDTA螯合劑，對細胞的外層膜有破壞作用。如E-coli；原因：二價陽離子，尤其是Mg2＋對革蘭氏陰性菌細胞被膜以外層膜的穩(wěn)定作用是重要的，EDTA的螯合作用導致外層膜不穩(wěn)定或去除。目前三十三頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點2).有機溶劑法可使細胞膜表面發(fā)生變化，胞內(nèi)產(chǎn)物可以釋放出來，由于沒有整體破碎細胞，可實現(xiàn)選擇性釋放.如采用異丙醇處理酵母，釋放超氧化物歧化酶，處理后，超氧化物歧化酶釋放率達90％，純化因子提高25。目前三十四頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點3).表面活性劑能夠作用細胞質(zhì)和細胞壁膜，膜結(jié)構(gòu)中的脂蛋白成分被或多或少地溶解，使細胞滲透作用有利于某些蛋白的通過。如：SDS等作用是溶解蛋白質(zhì)和擾亂蛋白－脂界面?；瘜W滲透法的優(yōu)點：避免大量細胞碎片，核酸留在胞內(nèi)，處理后，溶液很容易澄清，簡化后處理步驟，簡單的攪拌容器代替了機械破碎設備。缺點是價格昂貴，易污染產(chǎn)物，會導致產(chǎn)物活性和最優(yōu)產(chǎn)量的不可逆損失。目前三十五頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點3.生物法酶溶法是利用酶反應分解破壞細胞壁上特殊的鍵而達到破壁的目的，以提高胞內(nèi)產(chǎn)物和通透性。優(yōu)點：生物轉(zhuǎn)移性強，操作條件溫和、能量低、可避免高剪切力，確保產(chǎn)物破壞最小。缺點：費用高，時間長，多用于原生質(zhì)體自溶作用是酶溶的另一種方式，通過調(diào)節(jié)溫度，PH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細胞產(chǎn)生溶解自身的酶的方法，稱為自溶。目前三十六頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1）滲透壓沖擊法（OsmoticShock）將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細胞轉(zhuǎn)入緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速通過細胞壁和細胞膜進入細胞，引起細胞壁和膜膨脹破裂，從而使細胞通透性增大。4.細胞物理破碎方法原理目前三十七頁\總數(shù)三十九頁\編于十七點1、最溫和的一種方法2、選擇性高，釋放速度快，工藝簡單，易放大。3、適用于易破碎的細胞，和細胞壁預先受到酶處理的細胞，及合成受抑制而強度減弱的細胞，如動物細胞和革蘭氏陰性菌