體外診斷試劑研發(fā)工藝和思路剖析

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2023-03-2320:27在體外診斷試劑產(chǎn)品性能評估，原料占70%，工藝占20%，思路占10%。按《體外診斷試劑分析性能評估指導(dǎo)原則》，主要的分析性能評估項目有：檢測限、線性范圍、可報告范圍、準確度(回收實驗)、準確度(方法學(xué)比對)、精密度、干擾實驗、穩(wěn)定性、參考值。目前國際上通常是以美國臨床實驗室標準化組織(CLSI)的相關(guān)標準為依據(jù)。

產(chǎn)品性能評估是產(chǎn)品研發(fā)、制定產(chǎn)品標準等過程的重要技術(shù)支持研究過程，并可能對產(chǎn)品質(zhì)量造成一定影響。在整個研發(fā)過程中，涉及原料、工藝和思路，因為行業(yè)處于黃金發(fā)展階段，很少去關(guān)注和優(yōu)化整個研發(fā)流程，如果沒理順這三者關(guān)系，整個研發(fā)流程會陷入盲目與不可持續(xù)。剛接觸研發(fā)時，一般是以現(xiàn)有體系，包含穩(wěn)定的配方體系(包被緩沖液、封閉緩沖液、酶標緩沖液、校準品稀釋液、發(fā)光底物液)和工藝流程，一切就著拿來主義，用已有的配方，就著已有的工藝，按著流程操作，多數(shù)工作用于篩選配對，分析數(shù)據(jù)。

這個入門階段，一般至少維持2-3年，因為配方體系和工藝體系(以下簡稱工藝，包含配方和體系)是前人通過大量研究成果而建立的，一般比較穩(wěn)定，較少修改(就算要改進，權(quán)限也是在研發(fā)總監(jiān)手中)，加上整個研發(fā)思路已經(jīng)流程化，不用思考太多。很多新技術(shù)員，通過這種配對篩選后，會從一定數(shù)量的配對中篩選出比較合適的配對，進行下一環(huán)節(jié)研發(fā)，很容易就得出，一個試劑盒好壞，基本取決于原料質(zhì)量，如果沒有篩選到好原料，或者碰到難項目，就無從入手。

我們將原料、工藝和思路，細細拆解來分析，目的是理清性能評估項目中，哪些項目是原料決定的，哪些項目是工藝決定的，哪些項目是兩者共同影響的，促進研發(fā)思路的形成與成熟，希望能夠拋磚引玉。

一、原料

我們將免疫試劑中關(guān)鍵原料提煉出來，分為兩塊：抗原抗體和特殊成分。

1、抗原抗體

免疫試劑一般可以分為兩個過程：免疫反應(yīng)和顯色反應(yīng)。免疫反應(yīng)是核心，將待測物特異性地從復(fù)雜樣本中分離出來，這一環(huán)節(jié)的好壞，直接決定整個試劑的核心質(zhì)量。

在工業(yè)生產(chǎn)上，免疫檢測用的抗體，一般是通過工程菌表達抗原片段，免疫動物，進行多克隆或者單克隆抗體制備，然后得到的抗體，進行配對篩選，選出合適的配對應(yīng)用于免疫檢測。在這個過程中，由于待測抗原一般都是天然抗原(少數(shù)科研檢測重組抗原)，而制備和篩選抗體一般又是使用重組抗原，因此會帶來很多應(yīng)用問題，這個對抗體制備商來說，值得重視。

2、特殊成分

免疫反應(yīng)做為一個脆弱的非共價鍵結(jié)合過程，整個反應(yīng)受時間、干擾物、橋聯(lián)物、結(jié)構(gòu)類似物等影響，為消除這些不良影響，一般在緩沖體系中會增加一些特殊成分，這些特殊成分我們定義為次要原料，在工藝中詳述。

二、工藝

工藝包含配方體系和工藝流程，兩者相輔相成。所有的配方和工藝，是為保障和提高產(chǎn)品性能而設(shè)計的，當原料無法滿足產(chǎn)品性能要求時，如何通過配方工藝來提高，或者說，哪些性能能通過配方工藝來提高，如何來提高，哪些只能由原料決定，這個在我們研發(fā)職業(yè)生涯中，要不斷積累與完善。

1、配方體系

配方體系可以拆解為緩沖體系和改進體系。

(1)緩沖體系一般的緩沖體系，在教科書、產(chǎn)品說明書、論文中均可見到，主要包含離子對類型、離子濃度、pH值等內(nèi)容，非保密配方，比較容易理解與掌握。

(2)改進體系因為免疫反應(yīng)的非共價鍵結(jié)合的脆弱性，依靠一個簡單緩沖體系，要獲得很好的反應(yīng)結(jié)果，是比較困難的，針對這種問題，科學(xué)家設(shè)計了各種改進體系，這些體系下面，又有各種方法產(chǎn)生。

A、降低本底體系

使用合適的包被、標記濃度，一般采用棋盤滴定確定。

加入增加溶解率，降低非特異吸附的物質(zhì)，如曲通、吐溫。

B、減少干擾體系

加入正常鼠血清或者鼠IgG，降低人抗鼠抗體影響

加入阻斷劑，降低類風濕因子干擾

C、減少前帶效應(yīng)體系

適當提高包被和標記濃度，兼顧本底

加入檢測抗體裸抗，兼顧靈敏度

D、增加靈敏度體系

加入曲通、吐溫等

加入特殊物質(zhì)，如S19

E、提高檢出率體系

多個抗體聯(lián)合使用，如CnTI項目

F、提高穩(wěn)定性體系

緩沖液加入保護性蛋白、糖類、小分子化合物

G、等等其他體系隨著研究深入，這個目錄會不斷增加，相應(yīng)的方法也會不斷增多。

2、工藝流程

工藝流程，又包含生產(chǎn)工藝流程和試劑盒檢測操作工藝流程兩個方面。

(1)生產(chǎn)工藝流程生產(chǎn)工藝流程，對整個的產(chǎn)品性能，有非常大的影響，比如預(yù)包被板制備工藝，包被、封閉、干燥的溫度、時間，對整個性能影響很大，需要研發(fā)摸索。

(2)檢測操作工藝流程相比生產(chǎn)工藝，試劑盒的檢測操作工藝，對性能影響更大，一步法、兩步法，加樣量，加樣順序，溫育溫度，溫育時間。

三、思路

我們分析原料與工藝，就是為了找到一個合適的研發(fā)思路，指導(dǎo)研發(fā)過程，提高研發(fā)效率，整個研發(fā)思路，我們再劃分為產(chǎn)品研發(fā)和改進研發(fā)兩個問題。

1、產(chǎn)品研發(fā)

產(chǎn)品研發(fā)是一個從無到有的過程，多數(shù)是根據(jù)市面上已有的試劑，研發(fā)自己公司沒有的產(chǎn)品。這個過程占研發(fā)的大頭，我們再將其細分為初步研發(fā)、預(yù)臨床實驗和穩(wěn)定性測試三個過程。所有的研發(fā)，我們都必須知道，一個性能項目，他是怎么評估的，哪些因素會影響這個性能，如何改進，我們以雙抗體夾心為例列舉。

(1)初步研發(fā)初步研發(fā)時，一般重點強調(diào)三個活性成分：包被抗體、檢測抗體、校準品。包被抗體和檢測抗體，會有一個經(jīng)驗濃度，校準品一般用合適基質(zhì)，將抗原或者高值樣本進行梯度稀釋，獲取的梯度濃度進行第三方賦值，追溯到國際、國家或者企業(yè)標準品。

初步研發(fā)多數(shù)是在做配對篩選，只需要用檢測限、線性范圍、可報告范圍這三個性能評估項目，即可篩選出候選配對。比如拿到10株抗體，可以做成100個配對，進行篩選，選出初步可用的候選配對若干對。

對初篩的候選配對，進行精密度、準確度(回收實驗)、干擾實驗評估，通過這些實驗，再二次篩選候選配對。

(2)預(yù)臨床實驗不涉及臨床血清樣本的初步研發(fā)都完成后，獲得一定的候選配對，進行預(yù)臨床實驗，主要是評估準確度(方法學(xué)比較)和參考值區(qū)間。

(3)穩(wěn)定性測試通過上面兩個步驟，試劑盒初步成型，活性組分(包含預(yù)包被板、校準品、酶標抗體)的穩(wěn)定性，需要一一評價與改進，直到滿足要求。

2、改進研發(fā)

整個試劑盒的研發(fā)，最終就是為了檢測臨床血清樣本，所有的分析性能評估項目，也是為這個目的而設(shè)計，但是在整個研發(fā)過程中，不管是預(yù)臨床試驗，還是正式臨床試驗，配對測試的臨床血清樣本量，是非常有限的，頂多就算是完成一個小試生產(chǎn)。到真正產(chǎn)品上市和臨床應(yīng)用時，隨著樣本量的擴大，很多之前沒有暴露的