d-酶固定化蛋白質(zhì)工程

d-酶固定化蛋白質(zhì)工程第一頁，共113頁。第二頁，共113頁。第三頁，共113頁。第四頁，共113頁。第五頁，共113頁。第六頁，共113頁。第七頁，共113頁。第八頁，共113頁。第九頁，共113頁。第十頁，共113頁。UnderstandingenzymeimmobilisationEnzymesareversatilecatalystsinthelaboratoryandonanindustrialscale.Tobroadentheirapplicabilityinthelaboratoryandtoensuretheir(re)useinmanufacturingthestabilityofenzymescanoftenrequireimprovement.Immobilisationcanaddresstheissueofenzymaticinstability.Immobilisationcanalsohelptoenabletheemploymentofenzymesindifferentsolvents,atextremesofpHandtemperatureandexceptionallyhighsubstrateconcentrations.Atthesametimesubstrate-specificity,enantioselectivityandreactivitycanbemodified.However,mostoftenthemolecularandphysical-chemicalbasesofthesephenomenahavenotbeenelucidatedyet.ChemSocRev.2009Feb;38(2):453-68.HanefeldU,GardossiL,MagnerE.第十一頁，共113頁。RecentadvancesinimmobilizedenzymaticreactorsandtheirapplicationsinproteomeanalysisImmobilizedenzymaticreactorsrecentlyhavedrawnmuchattentionbecauseofthestrikingadvantages,suchashighsubstrateturnoverrateandeaseincouplingwiththeseparationanddetectionsystems.Carriermaterials,whichhavegreateffectsonthedevelopmentoftheimmobilizedenzymaticreactors,havealwaysbeingthefocusofstudy.Inthispaper,thecontributions,mainlyinthelast5years,ontheenzymaticreactorsandtheirapplicationsinproteomestudyarereviewed,withsomenewlydevelopedinorganicandorganiccarriersforenzymeimmobilizationdescribedindetails.Moreover,thehyphenationofimmobilizedenzymaticreactorswiththeseparationandidentificationsystemsisalsosummarized.Byreviewingtheseachievements,itcouldbeseenthatenzymaticreactorshaveverybrightfuture,especiallyinproteomeanalysisAnalChimActa.2009Jan19;632(1):1-8.MaJ,ZhangL,LiangZ,ZhangW,ZhangY.第十二頁，共113頁。固定化酶的研究內(nèi)容固定化方法載體酶學(xué)性質(zhì)——固定化酶的特性 穩(wěn)定性研究、改進(jìn) 最適溫度 最適pH 底物特異性第十三頁，共113頁。固定化酶的制備方法

（一）吸附法1．物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。

選擇載體的原則

（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面

（3）便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。第十四頁，共113頁。優(yōu)點(diǎn)： 固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象很少 或基本不發(fā)生變化。缺點(diǎn)： 結(jié)合力弱，易解吸附。載體： 纖維素、瓊脂糖、活性炭、 沸石及硅膠等。第十五頁，共113頁。（二）結(jié)合法1離子鍵結(jié)合法酶分子

含有離子交換基團(tuán)的固相載體常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度第十六頁，共113頁。2共價(jià)鍵結(jié)合法（1）酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵（2）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機(jī)載體第十七頁，共113頁。共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)關(guān)鍵然后活化該活潑基團(tuán)最后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵第十八頁，共113頁。（4）載體活化的方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應(yīng)法D．硅烷化法E．溴化氰法第十九頁，共113頁。A．重氮法目前用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等第二十頁，共113頁。A．重氮法反應(yīng)式及原理第二十一頁，共113頁。B疊氮法例用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：⑴酯化⑵肼解⑶疊氮化(4)偶聯(lián)第二十二頁，共113頁。B疊氮法對含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián)第二十三頁，共113頁。C．烷基化反應(yīng)法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。第二十四頁，共113頁。D．硅烷化法一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特點(diǎn)：①機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。②耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。第二十五頁，共113頁。D．硅烷化法第二十六頁，共113頁。D．硅烷化法第二十七頁，共113頁。D．硅烷化法第二十八頁，共113頁。E．溴化氰法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。第二十九頁，共113頁。E．溴化氰法第三十頁，共113頁。（三）交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。第三十一頁，共113頁。（三）交聯(lián)法常用試劑常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N’乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)第三十二頁，共113頁。雙功能試劑：

常用的是戊二醛 O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶第三十三頁，共113頁。圖酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶第三十四頁，共113頁。表常用于固定化酶的交聯(lián)劑 交聯(lián)劑 參考文獻(xiàn)戊二醛 13－16二重氮聯(lián)苯胺－2，2‘－二磺酸 17，184，4‘－二氟－3，3’－二硝基二苯砜 19二苯基－4，4‘－二硫氰酸－2，2’－二磺酸 201，5－二氟－2，4－二硝基苯 21酚－2，4－二磺酰氯 223－甲氧基二苯基甲烷－4，4‘－二異氰酸鹽 23第三十五頁，共113頁。（三）交聯(lián)法的形式交聯(lián)法有2種形式： 酶直接交聯(lián)法 酶輔助蛋白交聯(lián)雙重固定法

（1）吸附交聯(lián)法（2）交聯(lián)包埋法第三十六頁，共113頁。酶直接交聯(lián)法在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。第三十七頁，共113頁。酶輔助蛋白交聯(lián)為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學(xué)修飾而引起酶失活，可使用第二個(gè)“載體”蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。第三十八頁，共113頁。（1）吸附交聯(lián)法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。第三十九頁，共113頁。（2）交聯(lián)包埋法把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。這樣制得的固定化酶穩(wěn)定性好。第四十頁，共113頁。（四）包埋法（entrappingmethod）定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型1．網(wǎng)格型2．微囊型第四十一頁，共113頁。1．網(wǎng)格型(1)概念將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法第四十二頁，共113頁。2．微囊型包埋法是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。第四十三頁，共113頁。微囊化法制備固定化酶有兩種方法①界面沉淀法②界面聚合法第四十四頁，共113頁。①界面沉淀法這是一種簡單的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。第四十五頁，共113頁。②界面聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來。第四十六頁，共113頁。各類固定化方法的特點(diǎn)比較:比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費(fèi)用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶第四十七頁，共113頁?；瘜W(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶第四十八頁，共113頁。選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)（2）載體的性質(zhì)（3）制備方法的選擇第四十九頁，共113頁。固定化后酶的考察項(xiàng)目：（1）測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率。（2）考察固定化酶穩(wěn)定性（3）考察固定化酶最適反應(yīng)條件第五十頁，共113頁。一．影響固定化酶性質(zhì)的因素1．酶本身的變化發(fā)生了變化活性中心的氨基酸殘基高級(jí)結(jié)構(gòu)電荷狀態(tài)等第五十一頁，共113頁。一．影響固定化酶性質(zhì)的因素2．載體的影響（1）擴(kuò)散限制效應(yīng)（2）空間障礙效應(yīng)第五十二頁，共113頁。二．固定化后酶性質(zhì)的變化1．固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降原因？第五十三頁，共113頁。二．固定化酶的性質(zhì)2．固定化對酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。(3)對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。(4)對分解酶的穩(wěn)定性提高。（5）對變性劑的耐受力升高第五十四頁，共113頁。2．固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a.固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。b.抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。第五十五頁，共113頁。3．pH的變化PH對酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。第五十六頁，共113頁。4．最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會(huì)有較明顯的變化。5．底物特異性變化作用于低分子底物的酶特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會(huì)變化。第五十七頁，共113頁。6．米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km第五十八頁，共113頁。三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）第五十九頁，共113頁。三、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)：3.4.或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。5.相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力

第六十頁，共113頁。細(xì)胞固定化固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。第六十一頁，共113頁。固定化細(xì)胞的特點(diǎn)類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)：死細(xì)胞（完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器）活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。最多使用：顆粒狀珠體使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長期使用。第六十二頁，共113頁。固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長；細(xì)胞損傷程度低；易于更換培養(yǎng)液；細(xì)胞和培養(yǎng)液易于分離；培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡化了產(chǎn)品分離純化操作。第六十三頁，共113頁。第六十四頁，共113頁。細(xì)胞固定化培養(yǎng)法動(dòng)物細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)謂之細(xì)胞固定化培養(yǎng)法。動(dòng)物細(xì)胞幾乎都可采用固定化方法培養(yǎng)。固定化方法有：吸附法（所用載體有陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒）包埋法（將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中）第六十五頁，共113頁。吸附法它主要通過載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。第六十六頁，共113頁。影響吸附法的主要因素（1）Z-電位：Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大?。?）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)（3）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無機(jī)材料第六十七頁，共113頁。包埋固定法包埋法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。第六十八頁，共113頁。包埋法分類常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺常用凝膠包埋法第六十九頁，共113頁。舉例海藻酸鈣包埋法基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球狀固定化細(xì)胞第七十頁，共113頁。通過改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和溶劑等參數(shù)時(shí)，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，將細(xì)胞包埋其中。第七十一頁，共113頁。研究熱點(diǎn)——光交聯(lián)樹脂包埋法例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得第七十二頁，共113頁。固定化培養(yǎng)裝置多層平板裝置螺旋卷膜培養(yǎng)器多層托盤式培養(yǎng)器卷帶式培養(yǎng)器中空纖維及流化床式培養(yǎng)器第七十三頁，共113頁。中空纖維培養(yǎng)器優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞生長密度高，可達(dá)l08個(gè)／毫升以上，細(xì)胞處于接近生理狀態(tài)的理化梯度中；營養(yǎng)物質(zhì)可有效分布，代謝廢物可及時(shí)排除；細(xì)胞培養(yǎng)可達(dá)數(shù)月，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)；細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高。產(chǎn)品純度可高達(dá)60％一90％；利于降低成本；反應(yīng)器體積小并可用于培養(yǎng)多種細(xì)胞。第七十四頁，共113頁。微載體培養(yǎng)方法將動(dòng)物細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法稱為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。制備微載體的材料主要有：葡聚糖（DEAE—SephadexA50及A25）塑料明膠玻璃纖維素第七十五頁，共113頁。微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，且是均相培養(yǎng)。細(xì)胞所處環(huán)境均一，放大容易。培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動(dòng)化，障低了污染發(fā)生的機(jī)會(huì)。第七十六頁，共113頁。第七十七頁，共113頁。第七十八頁，共113頁。固定化原生質(zhì)體何為原生質(zhì)體？有何優(yōu)點(diǎn)？第七十九頁，共113頁。第八十頁，共113頁。一原生質(zhì)體的制備將對數(shù)生長期的細(xì)胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到原生質(zhì)體第八十一頁，共113頁。高滲緩沖液高滲緩沖液處理指對細(xì)胞或組織進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，即受體組織或細(xì)胞在適當(dāng)濃度的高滲液進(jìn)行一定時(shí)間的浸泡處理。靶體經(jīng)過高滲液一定時(shí)間的處理，體積縮小到原來的80%左右，細(xì)胞膜內(nèi)外形成一個(gè)滲透壓梯度。第八十二頁，共113頁。滲透壓調(diào)節(jié)能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，阻止細(xì)胞質(zhì)外滲，減少細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞的活性，在基因槍法、電擊穿孔法、微注射法等直接轉(zhuǎn)化方法都有應(yīng)用。第八十三頁，共113頁。首先必須消除細(xì)胞壁，它是微生物細(xì)胞之間進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換的主要障礙。通常采用蝸牛酶除去細(xì)胞壁，緩沖液

(1)0.1mol/LpH6.0磷酸緩沖液。

(2)高滲緩沖液，于上述緩沖液中加入0.8mol/L甘露醇。第八十四頁，共113頁。

原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)

0.5mol/L蔗糖、20mol/LMgC12、0.02mol/L順丁烯二酸，調(diào)pH6.5。(一)原生質(zhì)體的制備

1．活化菌體

將單倍體釀酒酵母菌Y-1和Y-4活化分別轉(zhuǎn)接新鮮斜面。自新鮮斜面分別挑取一環(huán)接入裝有25mL完全培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃培養(yǎng)16h至對數(shù)期。第八十五頁，共113頁。

2．離心洗滌、收集細(xì)胞

分別取5mL上述培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，3000r/min離心10min，棄上清液，向沉淀的菌體中加入5mL緩沖液，用無菌接種環(huán)，攪散菌體，振蕩均勻后離心洗滌一次，再用5mL高滲緩沖液離心洗滌一次。將菌體分別懸浮于5mL高滲緩沖液中，振蕩均勻，分別取樣0.5mL，用生理鹽水稀釋至10-6，分別各取0.1mL10-4、10-5、10-6稀釋液。于相應(yīng)編號(hào)的完全培養(yǎng)基平板上(每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平板)，用刮棒涂布，30℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行總菌數(shù)測定。第八十六頁，共113頁。

3.酶解脫壁

各取3mL菌液于無菌小試管中，3000r/min離心10min，棄上清液，加入3mL含2.0mg蝸牛酶的高滲緩沖液(此高滲緩沖液含有0.1％EDTA和0.3％SH-OH）于30℃振蕩保溫，定時(shí)取樣鏡檢觀察至細(xì)胞變成球狀原生質(zhì)體為止，此時(shí)原生質(zhì)體形成。第八十七頁，共113頁。

(二)原生質(zhì)體再生及剩余菌數(shù)的測定

1．再生

分別吸取0.5mL原生質(zhì)體(經(jīng)酶處理)加入裝有4.5mL高滲緩沖液及4.5mL無菌水試管中。經(jīng)高滲緩沖液稀釋至10-5；分別吸取0.1mL10-3、10-4、10-5。稀釋液于相應(yīng)編號(hào)的再生培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48h后，進(jìn)行再生菌數(shù)測定(用雙層再生培養(yǎng)基)。第八十八頁，共113頁。

2.未脫壁菌數(shù)測定

分別取0.5mL原生質(zhì)體至裝有無菌水試管中，稀釋到10-4；各取0.1mL10-2、10-3、10-4的稀釋液于相應(yīng)編號(hào)的完全培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48h后，進(jìn)行未脫壁菌數(shù)測定。第八十九頁，共113頁。二原生質(zhì)體固定化的方法將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。第九十頁，共113頁。四輔酶固定化1原因有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)有機(jī)輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴——工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生第九十一頁，共113頁。輔酶固定化的方法：2固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。3輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。

第九十二頁，共113頁。輔酶的固定化第九十三頁，共113頁。輔酶固定化的形式：第九十四頁，共113頁。圖生物催化劑作用方式示意生物催化劑細(xì)胞酶非生長生長可溶固定化懸浮固定化連續(xù)間歇吸附包埋交聯(lián)化學(xué)連續(xù)材料膜固定酶液凝膠吸附化學(xué)連接物固定化再循環(huán)系統(tǒng)凝膠吸附連續(xù)半連續(xù)分批間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應(yīng)器第九十五頁，共113頁。固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用（工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、分析化學(xué)、酶電極、親和色譜、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)、基礎(chǔ)理論研究）第九十六頁，共113頁。第九十七頁，共113頁。二．固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用1.

固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用3．固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用4．固定化酶和親和色譜5．固定化酶與環(huán)境保護(hù)6．新能源開發(fā)中的應(yīng)用7．固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用第九十八頁，共113頁。1．固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用葡萄糖異構(gòu)酶——世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類熱點(diǎn)：固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用第九十九頁，共11