瘧原蟲鏡檢技術(shù)-血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別課件

瘧原蟲鏡檢技術(shù)

-血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別

寄生人體的四種瘧原蟲

?間日瘧原蟲

[P.vivax，P.v]?惡性瘧原蟲

[P．Falciparum,P.f]?三日瘧原蟲[P．Malariae,P.m]?卵形瘧原蟲[P．Ovale,P.o]

我國常見間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；另二種少見，為國外輸入病例。

其它瘧原蟲

諾氏瘧原蟲[Plasmodiumnowlesi]

內(nèi)容提綱

?血片制作與染色

?瘧原蟲計數(shù)

?瘧原蟲的基本形態(tài)特征

血片制作

?第一步：載玻片的清洗

?用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水沖洗后涼干，浸于95%的乙醇中1小時以上

?用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。

第二步：患都信息的核實

采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和年齡并在玻片的右側(cè)編號。

第三步：采集血樣

采血部位：耳垂或無名指。

取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小,薄血膜血量為厚血膜的一半或1/3。

第四步：血片制作

厚血膜

用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜。

薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適

當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將

推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動，使血液沿邊緣散開，然后勻速地向前推進(jìn)，形成薄而平鋪的薄血膜。

薄血膜

厚血膜

制片過程圖示

標(biāo)簽

血片的制作

×

×

×

×

×

√

血片制作影響因素

?載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細(xì)胞均勻分布不重疊、無裂縫、無皺折和空泡，血膜末端呈舌狀；

?厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-10個白細(xì)胞為宜；

?血片制作場所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅等舔食血膜；

?制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果．

血片染色

兩種染色方法:

●吉氏染色法

1.染色原液配制

2.門診快染、慢染

3.成批染色和溶血染色

●

瑞氏染色法

WHO推薦使用吉氏染色法

吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g

甘油(純)250ml

甲醇(純)250ml

?

吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在

研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時間越長染色效果越好。

染色用水和沖洗用水配制

??血片的染色

常用中性的蒸餾水或經(jīng)煮沸過濾的冷開水

用pH7.0～pH7.2的緩沖液。

用水過酸，可致感染的RBC上的點(diǎn)彩染不出來；用水過堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍(lán)色，致使R的胞漿難以辨論。血片染色

?第一步：薄血膜的固定

?厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干

（要點(diǎn)：甲醇不能觸碰到厚血膜）

第二步：血片染色

?操作1（快染）

量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩緩沖洗，晾干（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。

?操作2(慢染)量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，

再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30min。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。

?成批血片染色

將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染

液（3毫升吉氏染色液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，染色30分鐘。

（如染液稀釋液不合標(biāo)準(zhǔn)時，得酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。

厚血膜溶血染色

放置多時未染色的血片（2天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，須在厚血膜上用清水進(jìn)行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。

染色質(zhì)量影響因素

?配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量；

?染液稀釋后使用時間：原液必須臨用時稀釋，隨配隨用；

?染液的稀釋濃度；

?染色時間。

染色質(zhì)量影響因素

?固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；

?血膜在制備后應(yīng)盡量能在當(dāng)天染色，一般夏天不超過48小時，冬天也不能超過72小時,放置時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。

瘧原蟲鏡檢

●

瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)

●

瘧原蟲密度計數(shù)方法

●

人體四種瘧原蟲的形態(tài)特征

瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)

厚血膜

優(yōu)點(diǎn)

血量多，面積小，原蟲

薄血膜

經(jīng)甲醇固定，紅細(xì)胞完整，原蟲形態(tài)改變不大，檢出率高

原蟲易于辨認(rèn)

缺點(diǎn)

原蟲在干燥過程中皺縮，血量比厚血膜少許多，紅細(xì)胞消失，原蟲變形較但面積是厚血膜的8-10倍。檢查費(fèi)時，原蟲檢大，原蟲鑒定困難

出率較低

用途

用于瘧疾病人檢查

原蟲蟲種、蟲期鑒定及初學(xué)者教學(xué)標(biāo)本

瘧原蟲密度計算

計算瘧原蟲密度的三種方法：

●

白細(xì)胞原蟲密度計數(shù)法

(厚血膜WHO)

優(yōu)點(diǎn)：可作為定性和定量分析

●

半定量計數(shù)法(厚血膜)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便

缺點(diǎn)：只能定性，不宜作為定量分析

●

紅細(xì)胞感染密度計算法

(薄血膜)白細(xì)胞原蟲密度計數(shù)法

?鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細(xì)胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低（200個白細(xì)胞中小于100個瘧原蟲），可增加白細(xì)胞，計數(shù)500個。

?密度單位:原蟲數(shù)/μl

?計算公式：瘧原蟲數(shù)

÷

計數(shù)的白細(xì)胞數(shù)

×

患者每微升血白細(xì)胞數(shù)=瘧原蟲數(shù)/μl血。

?如果不知患者的白細(xì)胞數(shù)，則每微升血以8000個白細(xì)胞計數(shù)(國際標(biāo)準(zhǔn))。

白細(xì)胞原蟲密度計數(shù)法

?從血膜的左上角開始，橫向。

?計數(shù)1個視野后，每次間隔5個視野,再計數(shù)。

厚血膜

白細(xì)胞原蟲密度計數(shù)方法

●

需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲計數(shù)的視野

如果該視野無原蟲，則計數(shù)白細(xì)胞數(shù)

×不需要計數(shù)的視野白細(xì)胞瘧原蟲計數(shù)法

●例如

計數(shù)200WBC中有120個瘧原蟲，在不知患

者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個白細(xì)

胞計數(shù),由此計算出每微升血液瘧原蟲密度為：

120（計數(shù)的瘧原蟲數(shù)）÷200（計數(shù)的白細(xì)胞）8000（每微升血白細(xì)胞數(shù)）

=4800/μl

答：該患者的瘧原蟲密度為4800/μl。

x半定量計數(shù)法

用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密度。此方法將密度分為6級：

1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以內(nèi)，記錄實際數(shù)字

2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”

3.平均每個視野1～5個蟲，記錄“＋”

4.平均每個視野6～10個蟲，記錄“++”

5.平均每個視野11～100個蟲，記錄“+++”

6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“++++”。

如：PfR+T++s7G少

這種方法簡便，缺點(diǎn)是計數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。

如何確定瘧原蟲血片為陰性

●

檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲

●

最少檢查100個厚血膜視野未查見

瘧原蟲（臨床病人）

瘧原蟲鏡檢

人體四種瘧原蟲的分布

惡性瘧

P.falciparum

?分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病

?四種瘧原蟲中致病力最強(qiáng)，無免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時治療可危及生命（腦型瘧）。

間日瘧P.vivax

?

遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱帶非洲，特別是西非則很少見。

?病程良性,有復(fù)發(fā)。

三日瘧P.malariae

?遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那

及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布。

卵形瘧

（蛋形瘧）

P.ovale

?主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報告。

瘧原蟲鏡檢

血細(xì)胞

紅細(xì)胞

血小板

白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）

???紅細(xì)胞

紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀

邊緣較厚，而中間較薄

??512346

2.嗜酸性粒細(xì)胞

3.嗜堿性粒細(xì)胞

4.中性粒細(xì)胞

75.淋巴細(xì)胞

6.單核細(xì)胞

7.血小板

各種血細(xì)胞模式圖

1.紅細(xì)胞

瘧原蟲的基本形態(tài)特征

?瘧原蟲基本構(gòu)造為細(xì)胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色素；

?原蟲：經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色；

?細(xì)胞漿：藍(lán)色或深藍(lán)色，隨著蟲體發(fā)育長大，細(xì)胞漿逐漸增多；

?核：呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。

核

胞漿

斑點(diǎn)

瘧原蟲的基本形態(tài)特征

?瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團(tuán)塊。

間日瘧原蟲：呈短棒狀，黃褐色；

惡性瘧原蟲：呈細(xì)砂狀，黑褐色；

三日瘧原蟲：呈砂粒狀，深褐色；

卵形瘧原蟲：與間日瘧原蟲相似。

瘧色素

惡性瘧（P.falciparum）

鑒定要點(diǎn)

?紅細(xì)胞不漲大

?環(huán)狀體纖細(xì),常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有2個核

?環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣

?除環(huán)狀體，配子體外沒有其他發(fā)育期

?配子體呈新月形或臘腸形

?成熟裂殖體約含8-26個裂殖子，排列不規(guī)則

?可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)

21.AmemberoftheUNforcesinEastTimor.Presentedwithhightemperature.

間日瘧（P.vivax）

鑒定要點(diǎn)

1.紅細(xì)胞明顯漲大

2.薛氏點(diǎn)明顯

3.成熟環(huán)狀體粗大

4.滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足

5.血片中可見各期的原蟲形態(tài)

6.成熟裂殖體約含12-24個裂殖子

2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.

三日瘧（P.malariae）

診斷要點(diǎn)

?紅細(xì)胞不漲大或略小

?環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚

?胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6-12個裂殖子

?雌雄配子體小于正常紅細(xì)胞，色素呈深褐色

??？刹橐姼麟A段的瘧原蟲

卵形瘧（P.ovale）

鑒定要點(diǎn)

1.紅細(xì)胞正?；蚵詽q大

2.常見慧星狀(也稱齒輪狀)3.環(huán)粗大

4.薛氏點(diǎn)明顯

5.成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲但更粗大

6.成熟裂殖體約含6-12個裂殖子

18.RecenttriptoSouthernIndia-headachesandvaguelyunwell.

厚血膜中四種人體瘧原蟲從主要鑒別要點(diǎn)

間日瘧原蟲

環(huán)狀體

核較大，胞漿粗厚，常有偽足

惡性瘧原蟲

核較小，常見2個核，胞漿纖細(xì)

在末稍血不常見，蟲體呈不規(guī)整圓形，有黑色瘧色素團(tuán)塊

三日瘧原蟲

核粗大，胞漿?？s成圓形，擁抱于核周

蟲體常呈帶狀，胞漿藍(lán)色深，瘧色素較多

卵形瘧原蟲

與三日瘧相似

大滋養(yǎng)體

蟲體較大，胞漿呈阿米巴運(yùn)動，有薛氏點(diǎn)

蟲體呈邊緣鋸齒狀的圓形

裂殖體