流式細胞術培訓課件

流式細胞術培訓講座生物物理所蛋白質(zhì)功能研究平臺流式組1980.1以前：1421980.1—1990.1:94501990.1—2000.1:33459.2000.1—2005.1:288502005.1—2009.4.15:29495科技文獻數(shù)量增長的一個簡單統(tǒng)計美國國立生物技術信息中心

PUBMED查詢：檢索關鍵詞：flowcytometry結果：目錄（一）.流式細胞術的功能特點與應用一.流式細胞儀的功能特點二.流式細胞術的應用（二）.流式細胞儀原理簡要一.流體動力學聚焦二.熒光光信號檢測

三.細胞分選四.實例及數(shù)據(jù)分析

（三）.制備和設計流式樣本一.樣本制備和實驗流程 二.設計熒光染料組合的幾個注意事項

（四）.流式細胞術的新發(fā)展（1）流式細胞儀的定義

流式細胞儀是指，使細胞（或其他粒子）以單個方式依次通過探測光束，采集細胞被光照時產(chǎn)生的各種信號，然后對信號進行處理，并能對多個參數(shù)進行關聯(lián)分析的一種儀器。一.流式細胞儀的功能特點（2）流式細胞儀與熒光顯微鏡類比熒光顯微鏡流式細胞儀視野,靜止,同時單個,流動,依次肉眼/CCDPMT多激發(fā)同時多激發(fā)(激光)一.流式細胞儀的功能特點

多通道（多參數(shù)）高通量 高靈敏度 定量 高精確度 細胞分選（3）流式細胞儀的功能特點原子0.1nm1nm10nm100nm1μm10μm100μm1mm氨基酸蛋白質(zhì)病毒支原體細菌紅細胞上皮細胞植物細胞電鏡光學顯微鏡人眼極限當前流式細胞儀可測量顆粒大小最小約0.2μm（2）測量對象：顆粒尺度

（單細胞懸浮液）（3）可測量的細胞參數(shù)

細胞膜：表面糖分子、細胞膜流動性和通透性、膜融合和翻轉、膜脂質(zhì)構成、細胞膜及線粒體膜電位等。細胞質(zhì)：（1）Ca2+、Na+、K+、H+（2）信號網(wǎng)絡蛋白、各種抗原、各類酶分子、細胞骨架蛋白、熒光蛋白（3）酶活、蛋白磷酸化、乙?；?、甲基化修飾等、核酸分析：DNA、RNA含量，DNA合成、降解、斷裂，區(qū)分核酸單、雙鏈，測量端粒長度、染色質(zhì)結構、堿基構成。染色單體分選。無需染色：大小，顆粒度，自發(fā)熒光，色素，絕對計數(shù)等流式細胞儀原理簡要一.流體動力學聚焦流動室流體動力學聚焦流速：10m/s最大40m/s——高通量20,000—200,000cell/S激光聚焦二.熒光檢測探測光路聚焦（1）空間立體激發(fā)結構三軸垂直：高精確度—2%的熒光差別（2）散射光信號的產(chǎn)生前向散射光：大小側向散射光：顆粒度FL-AFL-HFL-W面積（A）：熒光總量高度（H）：最大熒光強度寬度（W）：細胞直徑（3）PMT：光信號到電脈沖信號高靈敏度—50MESF（5）各色熒光信號分離二色反光鏡

123帶通濾光片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側向散射光，熒光多通道（多參數(shù)）另一個參數(shù)：時間—連續(xù)過程的檢測多激光激發(fā)：多通道（多參數(shù)）—6桿激光，17個熒光通道八角反射式信號收集系統(tǒng)（6）更先進的光信號收集和分離方式提高的靈敏度—(二色反光鏡)反射~透射:95%~80%FACSVantageDiva的模擬四路分選。四.實例與數(shù)據(jù)分析（1）紅細胞裂解后的外周血細胞檢測成分：樣本中的細胞有單核細胞，淋巴細胞，粒細胞染色：單克隆抗體標記

1）CD14存在于單核細胞表面。熒光染料：

Phycoerythrin（PE）

2）CD45以不同的密度存在于所有白細胞表面。（淋巴細胞>單核細胞>粒細胞）熒光染料：fluoresceinisothiocyanate(FITC).信號收集：FSC，SSC，PE/FITC雙熒光信號。細胞數(shù)：10，000。（2）DNA含量檢測高精確性—以及極小的儀器誤差（CV）！BDFASCalibur質(zhì)量控制：變異系數(shù)（CV）：流式細胞儀的“分辨率”。Tip：獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)的關鍵在于獲得小的CV值。（3）用流式細胞儀發(fā)現(xiàn)的側群細胞（SPCell）Hoechst33258ATChromomycinA3GC2456X89-127recip9-221314151617Y1820192221Ph1/313(4)染色體核型制備和設計流式樣本制取單細胞懸浮液熒光染色上機檢測數(shù)據(jù)分析機械破碎，酶解消化，化學解聚—去除碎步與團塊細胞吸收的熒光染料與其目標分子含量成正比，熒光信號強度與吸收的熒光染料分子成正比儀器校準和優(yōu)化結合生理現(xiàn)象分析數(shù)據(jù)實驗流程熒光染色設計的幾個原則了解儀器的激光/濾光片的組合匹配熒光亮度與最低密度的目標分子了解所用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射譜減小熒光光譜重疊使用多桿激光，但需避免多重激發(fā)小心使用組合染料（tandemdyes）設定合適的對照樣本（調(diào)節(jié)熒光補償?shù)臉颖荆?）熒光補償發(fā)射光譜重疊帶來干擾，需要將其進行補償JerryBarnhartCD45FITC信號“滲漏”到PE探測通道，CD4PE信號微弱的細胞不能被區(qū)分出來CD45PercP信號不“滲漏”到PE探測通道，CD4PE信號微弱的細胞被識別出來。JerryBarnhart（2）了解染料光譜，合理選擇組合多種熒光（3）選擇多桿激光，但注意避免雙重激發(fā)561nm激發(fā)光可更好的激發(fā)PE，但不能激發(fā)FITC，因此可避免熒光補償。JerryBarnhartCD19FITC22.5小時AmCyan+AmCyan-多重激發(fā)導致熒光信號“滲漏”，降低分辨力AmCyan：紫光及藍光激發(fā)FITC：藍光激發(fā)JerryBarnhart（4）使用組合染料需考慮其技術限制PECD8PE-Cy7CD3PE-Cy50小時2小時22.5小時(AlanStall&KenDavis)不穩(wěn)定性APC通道假陽性無假陽性PE通道假陽性PE通道假陽性無假陽性APC通道假陽性假陽性影響-APC-CY7+PE-Cy7+APC-CY7-PE-Cy7（JerryBarnhart）+APC-CY7+PE-Cy7流式細胞術的新進展一.流式細胞術法發(fā)展狀況儀器技術：90年代后期，現(xiàn)在已相對成熟；試劑，染料：取得很大進展，目前類型已非常豐富，但商業(yè)化普及有所不足；數(shù)據(jù)分析技術：遠滯后于前兩者，可能成為將來流式技術最大的進步。二.新應用數(shù)據(jù)分析技術：高內(nèi)容的多參數(shù)空間要求更有效的聚類算法；

k-均值聚類--混合高斯模型特異性磷酸化蛋白多色檢測試劑。

胞內(nèi)及表面染色：如MAPK，JNK，Erk，JAK/Stat等信號通路動力學，測繪信號網(wǎng)絡；基本機制研究；相關疾病診斷與治療。在當今系統(tǒng)生物學時代，了解蛋白相互作用的網(wǎng)絡，多參數(shù)流式細胞儀可成為一種關鍵性的工具。多參數(shù)流式細胞術改變了對抗原特異性T細胞反應的認識。

多維的免疫關聯(lián)性只能由多參數(shù)流式細胞術揭示。量子點染料技術得到大量應用。量子點染料與傳統(tǒng)抗體交聯(lián)：高亮，發(fā)射峰狹窄，更好的染色分辨率，更大的實驗設計空間。Beckman-Coulter的新流式細胞儀-2009年下半年。

謝謝BDFACSCaliburBDFACSAriaIIBDFACSVantageDivaBeckMan-CoulterMoFlo?XDP

BeckMan-CoulterMoFlo?XDP

BD

Influx-

7激光高速分選聲學耦合噴嘴二維位置分選光譜掃描Moflo

Astrios-7激光49色通道QuickReleaseNozzleSortChamberElectronicsPrecisionOpticalDevice(POD)LaserEnginesPressureConsoleModularLaserPalette355nmTrueUV(100mW)Upto6fibercoupledla