蛋白質(zhì)通論學(xué)習(xí)

蛋白質(zhì)通論學(xué)習(xí)第1頁/共106頁蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過肽鍵連接而成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質(zhì)量，復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質(zhì)。蛋白質(zhì)在生命中的重要性早在1878年，思格斯就在《反杜林論》中指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新?！笨梢钥闯?，第一，蛋白體是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；第二，生命是物質(zhì)運動的特殊形式，是蛋白體的存在方式；第三，這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝。一、蛋白質(zhì)通論第2頁/共105頁第2頁/共106頁

1.蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)必不可少的重要成分

蛋白質(zhì)占干重人體中（中年人）人體45%水55%

細(xì)菌50%~80%蛋白質(zhì)19%

真菌14%~52%脂肪19%

酵母菌14%~50%糖類＜1%

白地菌50%無機鹽7%

2.蛋白質(zhì)是一種生物功能的主要體現(xiàn)者（1）酶的催化作用（2）調(diào)節(jié)作用(多肽類激素)

（3）運輸功能（4）運動功能（5）免疫保護作用(干擾素)

（6）接受、傳遞信息的受體（7）毒蛋白3.外源蛋白質(zhì)有營養(yǎng)功能，可作為生產(chǎn)加工的對象第3頁/共105頁第3頁/共106頁蛋白質(zhì)的組成元素組成：碳50％、氫7％、氧23％、氮16％、硫0～3％、其他微量蛋白質(zhì)的平均含氮量：16％，凱式定氮法測量蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)含量＝蛋白氮×6.25（6.25即16％的倒數(shù)，為1g氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)））。第4頁/共105頁第4頁/共106頁按組成分：蛋白質(zhì)的分類單純蛋白質(zhì)：完全由氨基酸構(gòu)成，根據(jù)其物理性質(zhì)進行分類綴合蛋白質(zhì)：氨基酸＋輔基（非蛋白），根據(jù)其非氨基酸成分進行分類第5頁/共105頁第5頁/共106頁按生物學(xué)功能分：酶、調(diào)節(jié)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等按形狀分：纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)、膜蛋白按肽鏈的多少（相對分子質(zhì)量）分：

單體蛋白質(zhì)、寡聚蛋白質(zhì)（多聚蛋白質(zhì)）第6頁/共105頁第6頁/共106頁蛋白質(zhì)的形狀第7頁/共105頁第7頁/共106頁蛋白質(zhì)的大小與分子量

蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子。對任一種給定的蛋白質(zhì)來說，它的所有分子在氨基酸的組成和順序以及肽鏈的長度方面都應(yīng)該是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。第8頁/共105頁第8頁/共106頁蛋白質(zhì)分子量的變化范圍很大，從大約6000到1000000道爾頓（Da）或更大。某些蛋白質(zhì)是由兩個或更多個蛋白質(zhì)亞基(多肽鏈)通過非共價結(jié)合而成的，稱寡聚蛋白質(zhì)。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達數(shù)百萬甚至數(shù)千萬。第9頁/共105頁第9頁/共106頁蛋白質(zhì)通論第10頁/共105頁第10頁/共106頁單體蛋白質(zhì)：僅由一條多肽鏈構(gòu)成寡聚蛋白質(zhì)：兩條或多條多肽鏈構(gòu)成，其中每條多肽鏈稱為亞基，亞基之間通過非共價鍵相互締合不含輔基的蛋白質(zhì)，用110除它的相對分子質(zhì)量即可估計其氨基酸殘基的數(shù)目。（蛋白質(zhì)氨基酸的平均相對分子質(zhì)量約為138，但在多數(shù)蛋白質(zhì)中較小的氨基酸占優(yōu)勢，因此平均相對分子質(zhì)量接近128，形成肽鍵時除去一分子水，所以氨基酸平均相對分子質(zhì)量128-18＝110）第11頁/共105頁第11頁/共106頁蛋白質(zhì)的構(gòu)象蛋白質(zhì)的構(gòu)象：每一種天然蛋白質(zhì)都有自己的特有的空間結(jié)構(gòu)或稱三維結(jié)構(gòu)，這種三維結(jié)構(gòu)通常稱為構(gòu)象。構(gòu)象形態(tài)間的改變不涉及共價鍵的破裂。構(gòu)型的改變必需通過共價鍵的破裂的改變。第12頁/共105頁第12頁/共106頁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級結(jié)構(gòu)：基本結(jié)構(gòu)，多肽鏈的氨基酸序列，由肽鍵連接而成的結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈主鏈構(gòu)象主要動力：氫鍵主要形式：а－螺旋、β－折疊三級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象。四級結(jié)構(gòu)：

寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式。一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，高級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)功能。第13頁/共105頁第13頁/共106頁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次第14頁/共105頁第14頁/共106頁蛋白質(zhì)功能的多樣性第15頁/共105頁第15頁/共106頁

二肽（peptide）一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。（一）肽、肽鍵與肽平面由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。第16頁/共105頁第16頁/共106頁

肽鍵（peptidebond）肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。

0.127nm鍵長=0.132nm

0.149nm第17頁/共105頁第17頁/共106頁肽鍵平面的形成第18頁/共105頁第18頁/共106頁肽鍵第19頁/共105頁第19頁/共106頁肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。C-N鍵約有40％的雙鍵性質(zhì)，而C-O鍵具有40％單鍵性質(zhì)。組成肽基的4個原子和2個相鄰的Cа原子傾向于共平面，形成肽平面。兩個Cа可以處于順式構(gòu)型或反式構(gòu)型。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。但脯氨酸形成的肽鍵除外，可以是順式，也可以是反式的。第20頁/共105頁第20頁/共106頁第21頁/共105頁第21頁/共106頁肽單位

多肽鏈?zhǔn)怯稍S多氨基酸殘基通過肽鍵彼此連接而成的。多肽鏈主鏈骨架的重復(fù)單位就是肽單位，它是由肽鍵的4個原子與相連的兩個α－碳原子組成的基團。肽單位結(jié)構(gòu)基本上是固定的，有下列特征：1.肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵中的C-N鍵的鍵長為0.132nm，比大多數(shù)其他化合物的C-N單鍵（0.149nm）短，比C=N雙鍵（0.127nm）又長些。因此，肽鍵具有部分（約40％）雙鍵性質(zhì)；具有剛性，不能自由旋轉(zhuǎn)。第22頁/共105頁第22頁/共106頁2.肽單位是剛性平面結(jié)構(gòu)。即肽單位的6個原子都位于同一個剛性平面上，又稱肽平面或酞胺平面。3.肽單位中，C=O與N-H或兩個α－碳原子呈反式排布。這是因為反式構(gòu)型的能量比順式構(gòu)型的能量低。4.肽單位平面結(jié)構(gòu)有一定的鍵長和鍵角。

0.127nm鍵長=0.132nm

0.149nm第23頁/共105頁第23頁/共106頁肽鏈中AA的排列順序和命名第24頁/共105頁第24頁/共106頁第25頁/共105頁第25頁/共106頁在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈主鏈的一端含有一個游離的氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的羧基，稱為羧基端或C-端。如果多肽鏈主鏈末端的氨基和羧基連接起來，則稱環(huán)狀肽或環(huán)肽。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。肽的命名是根據(jù)參與其組成的氨基酸殘基來確定的，規(guī)定從肽鏈的NH2末端氨基酸殘基開始，稱某氨基酰某氨基酰……某氨基酸。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰氨第26頁/共105頁第26頁/共106頁四肽的結(jié)構(gòu)第27頁/共105頁第27頁/共106頁（二）肽的重要理化性質(zhì)1.熔點高。這說明它和氨基酸一樣，是以偶極離子形式形成離子晶格而存在的。2.具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點。肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端-NH2和游離末端-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點。

第28頁/共105頁第28頁/共106頁3.具有旋光性。這是由于肽中有不對稱C原子存在。一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和。但是較長的肽，其旋光度則不等于其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。4.具雙縮脲反應(yīng)。這是肽和蛋自質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應(yīng)。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物與CuSO4堿性溶液都能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色或藍紫色的復(fù)合物，利用此反應(yīng)借助分光光度法可測定肽或蛋白質(zhì)含量。第29頁/共105頁第29頁/共106頁5.具紫外吸收。如果肽中存在有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，則在280nm處有最大吸收峰。利用這個特性可對肽類進行定量測定。6.其他反應(yīng)。由于肽中存在游離的-NH2和游離-COOH，所以能進行茚三酮反應(yīng)、?；磻?yīng)、酯化反應(yīng)等許多反應(yīng)。第30頁/共105頁第30頁/共106頁第31頁/共105頁第31頁/共106頁

在給定的pH下，根據(jù)Henderson－Hasselbalch方程不難確定出每個側(cè)鏈占優(yōu)勢的電離態(tài)。我們只需掌握這樣一個規(guī)則：當(dāng)溶液pH大于解離側(cè)鏈的PKa值，占優(yōu)勢的離子形式是該側(cè)鏈的共軛堿，當(dāng)溶液的pH小于解離側(cè)鏈的PKa值，占優(yōu)勢的離子形式是它的共軛酸，即：第32頁/共105頁第32頁/共106頁第33頁/共105頁第33頁/共106頁第34頁/共105頁第34頁/共106頁第35頁/共105頁第35頁/共106頁（三）天然存在的重要多肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，生物體也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽（activepeptide）。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。第36頁/共105頁第36頁/共106頁與真核生物的RNA聚合酶牢固結(jié)合第37頁/共105頁第37頁/共106頁第38頁/共105頁第38頁/共106頁三蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定1.定義——1969年，國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會（IUPAC）規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。第39頁/共105頁第39頁/共106頁

2.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。

第40頁/共105頁第40頁/共106頁a、樣品必需純（>97%以上）；b、知道蛋白質(zhì)的相對分子量；c、知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；（1）測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的要求第41頁/共105頁第41頁/共106頁蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定測定多肽鏈的數(shù)目蛋白質(zhì)測序的步驟拆分多肽鏈斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵測定每一肽鏈的氨基酸組成鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端裂解多肽鏈為較小的肽段測定各肽段的氨基酸序列利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)確定二硫鍵的位置第42頁/共105頁第42頁/共106頁

(2)測定步驟A.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。B.多肽鏈的拆分由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。第43頁/共105頁第43頁/共106頁幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍或高濃度鹽處理，即可分開多肽鏈(亞基)；如果多肽鏈間是通過共價二硫橋連接的，如胰島素，可采用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷裂。第44頁/共105頁第44頁/共106頁第45頁/共105頁第45頁/共106頁

(2)測定步驟C.二硫鍵的斷裂

多肽鏈間或內(nèi)通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（如，ICH2COOH）保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。第46頁/共105頁第46頁/共106頁第47頁/共105頁第47頁/共106頁SSSSSS胰島素HO-CH2-CH2-SHSHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOH-巰基乙醇二硫鍵的斷裂巰基（-SH）的保護第48頁/共105頁第48頁/共106頁D氨基酸組成的分析蛋白質(zhì)的組成分析可用酸水解，同時輔以堿水解。水解中氨基酸遭破壞的程度與保溫時間呈線性關(guān)系，因此該氨基酸在蛋白質(zhì)中的真實含量可通過不同的保溫時間測出樣品中該氨基酸的含量并外推出至零時間的含量的方法求出。蛋白質(zhì)的氨基酸組成一般用每摩爾蛋白質(zhì)中含氨基酸殘基的摩爾數(shù)表示，或用每100g蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)表示。第49頁/共105頁第49頁/共106頁

測定每條多肽鏈的氨基酸組成第50頁/共105頁第50頁/共106頁第51頁/共105頁第51頁/共106頁

(2)測定步驟

E.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第52頁/共105頁第52頁/共106頁Sanger法：2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽或DNP-蛋白質(zhì)）。DNP-多肽在酸性條件下水解，只有N-末端氨基酸為黃色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游離氨基酸。只要鑒別所生成的DNP-氨基酸，就可得知N-末端氨基酸。該產(chǎn)物能夠用有機溶劑（如乙醚、乙酸乙酯）抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。N-末端基氨基酸測定二硝基氟苯（DNFB）法第53頁/共105頁第53頁/共106頁在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到110-9mol，比DNFB法高100倍。DNS-氨基酸不需要抽提，可直接用紙電泳或者薄層層析加以鑒定。N-末端基氨基酸測定丹磺酰氯（DNS）法第54頁/共105頁第54頁/共106頁多肽或蛋白質(zhì)的末端氨基能與PITC（Edman試劑）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質(zhì)，簡稱PTC-多肽或PTC-蛋白質(zhì)。后者在酸性有機溶劑中加熱時，N一末端的PTC一氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物并從肽鏈上掉下來，除去N-末端氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的，因為PTC基的引入只使第一個肽鍵的穩(wěn)定性降低。反應(yīng)液中代表N-末端殘基的PTH-氨基酸，經(jīng)有機溶劑抽提干燥后，可用薄層層折、氣相色譜和HPLC等進行鑒定。此方法還可以用來測定氨基酸序列。苯異硫氰酸酯（PITC）法N-末端基氨基酸測定第55頁/共105頁第55頁/共106頁氨肽酶是一類肽鏈外切酶或叫外肽酶，它們能從多肽鏈的N－末端逐個地向里切。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和殘基釋放量作動力學(xué)曲線，就能知道該蛋白質(zhì)的N-末端殘基序列。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（LAP），亮氨酸氨肽酶不是只能水解以Leu為N-末端殘基的肽鍵，只是水解以Leu為N-末端的肽鍵速度為最大。氨肽酶法N-末端基氨基酸測定第56頁/共105頁第56頁/共106頁序列是Gly-Ser-Val第57頁/共105頁第57頁/共106頁此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。游離的C-端氨基酸可用FDNB法或DNS法及層析技術(shù)進行鑒定。肼解過程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破壞不易測出，C-末端的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸。C-末端基氨基酸測定肼解法第58頁/共105頁第58頁/共106頁還原法C-末端基氨基酸測定肽鏈C一末端氨基酸也可用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的α-氨基醇。肽鏈完全水解后，代表原來C-末端氨基酸的α-氨基醇，可用層析法加以鑒別。第59頁/共105頁第59頁/共106頁羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解AA。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。C-末端基氨基酸測定羧肽酶(carboxypeptidase)法第60頁/共105頁第60頁/共106頁目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。羧肽酶(carboxypeptidase)法C-末端基氨基酸測定第61頁/共105頁第61頁/共106頁（2）測定步驟F.多肽鏈斷裂成多個肽段

可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽鏈斷裂法：酶解法和化學(xué)法第62頁/共105頁第62頁/共106頁酶解法:最常用的蛋白水解酶：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，又叫肽鏈內(nèi)切酶或內(nèi)肽酶。多肽鏈的選擇性降解第63頁/共105頁第63頁/共106頁Trypsinase：R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2第64頁/共105頁第64頁/共106頁

有時待測的多肽鏈中賴氨酸殘基和（或）精氨酸殘基的數(shù)量較多，為了減少胰蛋白酶的作用位點，可以通過化學(xué)修飾將其側(cè)鏈基團保護起來。例如用馬來酸酐（即順丁烯二酸酐）可以保護Lys殘基側(cè)鏈上的ε-NH2，這樣胰蛋白酶就不會水解Lys殘基的羧基端肽鍵，只能斷裂Arg殘基羧基端的肽鍵。反之，如果用1，2-環(huán)己二酮修飾Arg的胍基，則胰蛋白酶只能斷裂Lys殘基羧基端的肽鍵。如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶斷裂點，可以用氮丙啶處理多肽鏈樣品，這對Cys殘基側(cè)鏈被修飾成類似Lys的側(cè)鏈，也具有ε-NH2。這樣，胰蛋白酶便能斷裂Cys殘基羧基端的肽鍵。胰蛋白酶第65頁/共105頁第65頁/共106頁或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點糜蛋白酶第66頁/共105頁第66頁/共106頁Pepsin：R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro不水解。肽鏈水解位點胃蛋白酶第67頁/共105頁第67頁/共106頁thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。肽鏈水解位點嗜熱菌蛋白酶第68頁/共105頁第68頁/共106頁木瓜蛋白酶R1=Arg或Lys第69頁/共105頁第69頁/共106頁前者又叫谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(pH7.8磷酸緩沖液);R1=Glu(pH7.8碳酸氫銨緩沖液或pH4.0醋酸銨緩沖液)后者又叫精氨酸蛋白酶：R1=Arg肽鏈水解位點葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶第70頁/共105頁第70頁/共106頁

化學(xué)法：可獲得較大的肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。第71頁/共105頁第71頁/共106頁羥胺（NH2OH）：專一性斷裂-Asn-Gly-之間的肽鍵。也能部分裂解-Asn-Leu-之間的肽鍵以及-Asn-Ala-之間的肽鍵。第72頁/共105頁第72頁/共106頁

（2）測定步驟G.分離肽段,測定每個肽段的氨基酸順序。第73頁/共105頁第73頁/共106頁Edman（苯異硫氰酸酯PITC法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行解離。Edman氨基酸順序分析法第74頁/共105頁第74頁/共106頁第75頁/共105頁第75頁/共106頁第76頁/共105頁第76頁/共106頁

Edman降解法現(xiàn)在已有多種改進形式。例如DNS－Edman測序法，它是用前述的DNS法測定肽鏈的N一末端賤基，用Edman降解法提供逐次減少一個殘基的肽鏈樣品。此外為提高檢出被釋放殘基（PTH一氨基酸）的靈敏度，采用熒光基團或有色基團等標(biāo)記的PITC試劑，如4一N，N一二甲氨基偶氮苯－4，－異硫氰酸酯（縮寫為DABITC）就是改進的有色Edman降解試劑。生成的PTH－氨基酸在紫外區(qū)有強吸收，可利用各種層析技術(shù)分離。第77頁/共105頁第77頁/共106頁第78頁/共105頁第78頁/共106頁

測定每條多肽鏈的氨基酸組成第79頁/共105頁第79頁/共106頁（2）測定步驟H.確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定第80頁/共105頁第80頁/共106頁示例(十肽的水解)A法水解得到四個小肽：

A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到三個小肽：

B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val第81頁/共105頁第81頁/共106頁N-末端殘基HC-末端殘基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO氨基酸順序怎樣排列？第82頁/共105頁第82頁/共106頁（2）測定步驟I.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置采用胃蛋白酶水解：切點多，二硫鍵穩(wěn)定第83頁/共105頁第83頁/共106頁一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈(切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換)。將所得的肽段利用Brown及Hartlay的對角線電泳技術(shù)進行分離。二硫鍵位置的確定第84頁/共105頁第84頁/共106頁SSHCOOOHSO3HSO3H第85頁/共105頁第85頁/共106頁+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段第86頁/共105頁第86頁/共106頁將每對含磺基丙氨酸的肽段取下，進行氨基酸序列分析，然后與多肽鏈的氨基酸序列比較，即可推斷出二硫鍵在肽鏈間或肽鏈內(nèi)的位置。二硫鍵位置的確定第87頁/共105頁第87頁/共106頁3.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)舉例（1）胰島素（Insulin）A鏈B鏈一個鏈內(nèi)二硫鍵和兩個鏈間二硫鍵，分子量5700A鏈21個aa殘基B鏈30個aa殘基第88頁/共105頁第88頁/共106頁

（2）牛胰核糖核酸酶（RNase）

一條多肽鏈，124AA殘基組成，四個鏈內(nèi)二硫鍵，分子量12600。它是測出一級結(jié)構(gòu)的第一個酶分子。第89頁/共105頁第89頁/共106頁四蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系

（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化1、同源蛋白質(zhì)——在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，稱為序列同源性。具有明顯序列同源的蛋白質(zhì)也稱為同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)含有不變殘基和可變殘基。2、細(xì)胞色素C

細(xì)胞色素C是真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上一種含F(xiàn)e的蛋白質(zhì)，在生物氧化中起傳遞電子的作用。第90頁/共105頁第90頁/共106頁血紅素結(jié)合部位酶結(jié)合部位第91頁/共105頁第91頁/共106頁

通過植物、動物和微生物等數(shù)百種生物的細(xì)胞色素C一級結(jié)構(gòu)的研究表明：（1）親緣關(guān)系越近，AA順序的同源性越大。

不同生物與人的細(xì)胞色素C相比較AA差異數(shù)目黑猩猩0雞、火雞13牛豬羊10海龜15狗驢11小麥35粗糙鏈孢霉43酵母菌44

（2）盡管不同生物間親緣關(guān)系差別很大，但與細(xì)胞色素C功能密切相關(guān)的AA順序卻有共同之處，即保守順序不變（不變殘基）第92頁/共105頁第92頁/共106頁（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源1、氧合血紅素蛋白肌紅蛋白、血紅蛋白的α鏈和β鏈?zhǔn)侵榈鞍?，它們有很高的序列同源。人肌紅蛋白和人α-珠蛋白鏈有38個氨基酸是相同的，人α-珠蛋白和人β-珠蛋白有64個殘基是共同的。第93頁/共105頁第93頁/共106頁20世紀(jì)以氨基酸為原料合成了一