蛋白質(zhì)工程緒論

蛋白質(zhì)工程緒論第1頁/共24頁一、pro工程的概念1、pro工程的誕生1983年，美國生物學家Ulmer博士在《Science》上發(fā)表了以“ProteinEngineering”為題的專論，首次明確提出pro工程的概念，標志著pro工程的誕生。第2頁/共24頁2、pro工程的概念蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程是指通過生物技術(shù)手段對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對編碼蛋白質(zhì)的基因進行改造，以便獲的更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù)。第3頁/共24頁蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學、蛋白質(zhì)晶體學和動力學的研究，獲取有關(guān)蛋白質(zhì)物理和化學等各方面的信息，在此基礎上利用生物技術(shù)手段對蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進行有目的的改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的過程。被稱為“第二代基因工程”

第4頁/共24頁Pro工程誕生的基礎1）新的克隆技術(shù)，特別是完整的cDNA克隆技術(shù)；2）快速測定DNA序列測定；3）從DNA序列推算pro順序的較好的計算機程序；4）pro順序數(shù)據(jù)庫的建立，使一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白能被很快地鑒定出來，并由此研究其功能上的相似性；5）對原核生物和真核生物基因表達調(diào)控的進一步深入了解；6）用基因體外誘變的化學、酶學和合成技術(shù)的進展；7）X光晶體學的進展，包括較好的長浸提策略，同步輻射的應用，電子區(qū)域檢測器的出現(xiàn)，以及計算機輔助的數(shù)據(jù)分析；8）用計算機圖像系統(tǒng)為工具直接觀察晶體數(shù)據(jù)；9）核磁共振技術(shù)的改進，使溶液中原子分布能得到直接檢測。第5頁/共24頁二、pro工程的程序篩選純化需要改造的目的蛋白，研究其特性常數(shù)等；制備結(jié)晶，并通過aa測序、X射線晶體衍射分析、核磁共振分析等研究，獲得pro結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的數(shù)據(jù)；結(jié)合生物信息學的方法對pro的改造進行分析由aa序列及其化學結(jié)構(gòu)預測pro的空間結(jié)構(gòu)，確定pro結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進而從中找出可以修飾的位點和可能的途徑；第6頁/共24頁根據(jù)aa序列設計核酸引物或探針，并從cDNA文庫或基因文庫中獲取編碼該蛋白的基因序列；在基因改造方案設計的基礎上，對編碼蛋白的基因序列進行改造，并在不同的表達系統(tǒng)中表達；分離純化表達產(chǎn)物，并對表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能進行檢測等。第7頁/共24頁第8頁/共24頁三、pro工程的研究內(nèi)容

1、pro的結(jié)構(gòu)和功能2、pro的結(jié)構(gòu)、功能設計和預測3、pro的結(jié)構(gòu)修飾第9頁/共24頁1、pro的結(jié)構(gòu)和功能

每一種pro有自己獨特的aa順序，pro功能部位的幾個aa殘基決定著pro的功能，這幾個負責功能的aa殘基必須處于一個及其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。這就是說，只要能維持pro結(jié)構(gòu)域的必需aa及空間構(gòu)象不變，其功能域的生物學活性就會保持不變。所以只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能通過改變aa達到改造pro的目的。第10頁/共24頁pro分子設計按照被改造部位的多寡分為三種類型：2、pro的結(jié)構(gòu)、功能設計和預測“大改”，即在了解pro結(jié)構(gòu)和功能的基礎上，從pro一級結(jié)構(gòu)出發(fā)，設計自然界不存在的全新pro。“小改”：對已知結(jié)構(gòu)的pro進行幾個殘基的替換來改善pro的結(jié)構(gòu)和功能；“中改”：對天然pro分子進行大規(guī)模地肽鏈或結(jié)構(gòu)域替換以及對不同pro的結(jié)構(gòu)域進行拼接組裝；第11頁/共24頁

通過物理、化學法修飾pro側(cè)鏈基團、水解肽鏈等；生物化學法利用蛋白酶選擇性分割pro，采用基因重組技術(shù)或人工合成DNA，改造蛋白，甚至合成新的pro。3、pro的結(jié)構(gòu)修飾第12頁/共24頁四、pro工程的產(chǎn)生與發(fā)展

1、pro工程與其他技術(shù)相互滲透（1）pro工程與發(fā)酵工程發(fā)酵工程可以利用基因技術(shù)和細胞雜交技術(shù)選育出一大批生長速度快、代謝能力強、易于大量表達外源產(chǎn)物的新菌種，可為pro工程提供優(yōu)良穩(wěn)定的工程菌株，并可為pro工程中前期材料的制備等奠定重要基礎。第13頁/共24頁（2）pro工程與基因工程

pro工程是從DNA水平改變基因入手，通過體外重組技術(shù)改造pro或設計合成具有特定功能新pro的新興研究領(lǐng)域，也就是說pro的改造通常需要經(jīng)過周密的分子設計，進而依賴基因工程獲得突變型pro。目前，基因工程已為實現(xiàn)pro工程提供了基因克隆、表達、突變及活性檢測等關(guān)鍵技術(shù)。第14頁/共24頁（3）pro工程與細胞工程細胞工程是指以細胞為單位，在細胞和亞細胞水平上有目的地進行遺傳操作，通過細胞融合、核移植等方法，培養(yǎng)出人們需要的新物種，克服了源遠雜交的局限性。目前，細胞工程技術(shù)已為pro工程提供了改良性狀的微生物細胞以及穩(wěn)定的動植物細胞系，以便更好的生產(chǎn)pro；另外，細胞工程可通過細胞融合、轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變生物的遺傳性狀或?qū)崿F(xiàn)新型生物的構(gòu)建，進而為pro的生產(chǎn)提供更多良好的載體。第15頁/共24頁（4）pro工程與酶工程由于大部分酶的化學本質(zhì)是pro，因此酶工程與pro工程的發(fā)展密不可分。第16頁/共24頁（5）pro工程與生物信息技術(shù)利用生物信息學可以進行pro結(jié)構(gòu)的預測，其目的就是利用已知的一級序列來構(gòu)建pro的立體結(jié)構(gòu)模型。第17頁/共24頁2、pro工程的發(fā)展簡史1926年，Sumner從刀豆中提純了脲酶，首次證明酶的本質(zhì)是pro。1932年，英國化學家Krebs等提出合成尿素的鳥氨酸循環(huán)多酶反應途徑。1937年，Krebs公布了三羧酸循環(huán)的研究成果。1940年，德國生化學家Embclen和Megerbof公布了糖酵解途徑。隨后，脂肪酸氧化和核苷酸代謝途徑也相繼被闡明。同時期，我國生物化學家吳憲等提出pro變性學說。第18頁/共24頁1953年，英國生物化學家桑格破譯出由17種51個aa組成的牛胰島素兩條多肽鏈的全部結(jié)構(gòu)。1965年，我國首先在世界上成功人工合成了具有天然生物活力的pro——結(jié)晶牛胰島素。1975年，O’Farrel建立了雙向電泳（2-DE）技術(shù)，可以用于組織與細胞中大規(guī)模pro的分離。20世紀80年代末期，Hillenkamp發(fā)展了激光解吸質(zhì)譜，F(xiàn)enn設計了電噴霧質(zhì)譜，可以高效、精確地測量生物大分子的質(zhì)量并測定部分序列，進而用于數(shù)據(jù)庫的檢測；Mann通過建立“肽指紋圖譜與肽序列標簽”等技術(shù)，實現(xiàn)了質(zhì)譜準確、快速、自動化和大規(guī)模鑒定pro的飛躍。第19頁/共24頁1982年，Winter等首次報道通過基因定點誘變獲得改性。1983年，Ulmer在《Science》上發(fā)表了ProteinEngineering的專論，標志著pro工程的正式誕生。1982年~1985年，F(xiàn)orsht等對酪氨酰tRNA合成酶的分子進行了改造，根據(jù)X射線衍射實測該酶與底物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)，通過定點突變技術(shù)改變與底物結(jié)合的aa殘基，還用動力學方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機制，這就是最早的pro工程。第20頁/共24頁1984年，Perry通過將溶菌酶中Ile3改成Cys3，并進一步氧化成Cys3-Cys97二硫鍵，提高了酶的熱穩(wěn)定性，顯著改進了溶菌酶在食品工業(yè)的應用價值。1987年，F(xiàn)orsht將枯草桿菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而導致活性中心His64質(zhì)子pKa從7降到6，使酶在pH=6時的活力提高10倍。工業(yè)用酶最佳pH的改變預示著其可帶來巨大的經(jīng)濟效益。第21頁/共24頁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系

其關(guān)系是相互的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的分子基礎，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征決定了蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。