蛋白質(zhì)工程緒論

蛋白質(zhì)工程緒論第1頁(yè)/共24頁(yè)一、pro工程的概念1、pro工程的誕生1983年，美國(guó)生物學(xué)家Ulmer博士在《Science》上發(fā)表了以“ProteinEngineering”為題的專論，首次明確提出pro工程的概念，標(biāo)志著pro工程的誕生。第2頁(yè)/共24頁(yè)2、pro工程的概念蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程是指通過生物技術(shù)手段對(duì)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造，以便獲的更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù)。第3頁(yè)/共24頁(yè)蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究，獲取有關(guān)蛋白質(zhì)物理和化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上利用生物技術(shù)手段對(duì)蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進(jìn)行有目的的改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的過程。被稱為“第二代基因工程”

第4頁(yè)/共24頁(yè)P(yáng)ro工程誕生的基礎(chǔ)1）新的克隆技術(shù)，特別是完整的cDNA克隆技術(shù)；2）快速測(cè)定DNA序列測(cè)定；3）從DNA序列推算pro順序的較好的計(jì)算機(jī)程序；4）pro順序數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，使一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白能被很快地鑒定出來(lái)，并由此研究其功能上的相似性；5）對(duì)原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控的進(jìn)一步深入了解；6）用基因體外誘變的化學(xué)、酶學(xué)和合成技術(shù)的進(jìn)展；7）X光晶體學(xué)的進(jìn)展，包括較好的長(zhǎng)浸提策略，同步輻射的應(yīng)用，電子區(qū)域檢測(cè)器的出現(xiàn)，以及計(jì)算機(jī)輔助的數(shù)據(jù)分析；8）用計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)為工具直接觀察晶體數(shù)據(jù)；9）核磁共振技術(shù)的改進(jìn)，使溶液中原子分布能得到直接檢測(cè)。第5頁(yè)/共24頁(yè)二、pro工程的程序篩選純化需要改造的目的蛋白，研究其特性常數(shù)等；制備結(jié)晶，并通過aa測(cè)序、X射線晶體衍射分析、核磁共振分析等研究，獲得pro結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的數(shù)據(jù)；結(jié)合生物信息學(xué)的方法對(duì)pro的改造進(jìn)行分析由aa序列及其化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)pro的空間結(jié)構(gòu)，確定pro結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進(jìn)而從中找出可以修飾的位點(diǎn)和可能的途徑；第6頁(yè)/共24頁(yè)根據(jù)aa序列設(shè)計(jì)核酸引物或探針，并從cDNA文庫(kù)或基因文庫(kù)中獲取編碼該蛋白的基因序列；在基因改造方案設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)編碼蛋白的基因序列進(jìn)行改造，并在不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)；分離純化表達(dá)產(chǎn)物，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行檢測(cè)等。第7頁(yè)/共24頁(yè)第8頁(yè)/共24頁(yè)三、pro工程的研究?jī)?nèi)容

1、pro的結(jié)構(gòu)和功能2、pro的結(jié)構(gòu)、功能設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)3、pro的結(jié)構(gòu)修飾第9頁(yè)/共24頁(yè)1、pro的結(jié)構(gòu)和功能

每一種pro有自己獨(dú)特的aa順序，pro功能部位的幾個(gè)aa殘基決定著pro的功能，這幾個(gè)負(fù)責(zé)功能的aa殘基必須處于一個(gè)及其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。這就是說(shuō)，只要能維持pro結(jié)構(gòu)域的必需aa及空間構(gòu)象不變，其功能域的生物學(xué)活性就會(huì)保持不變。所以只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個(gè)或兩個(gè)堿基就能通過改變aa達(dá)到改造pro的目的。第10頁(yè)/共24頁(yè)pro分子設(shè)計(jì)按照被改造部位的多寡分為三種類型：2、pro的結(jié)構(gòu)、功能設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)“大改”，即在了解pro結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，從pro一級(jí)結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計(jì)自然界不存在的全新pro?！靶「摹保簩?duì)已知結(jié)構(gòu)的pro進(jìn)行幾個(gè)殘基的替換來(lái)改善pro的結(jié)構(gòu)和功能；“中改”：對(duì)天然pro分子進(jìn)行大規(guī)模地肽鏈或結(jié)構(gòu)域替換以及對(duì)不同pro的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝；第11頁(yè)/共24頁(yè)

通過物理、化學(xué)法修飾pro側(cè)鏈基團(tuán)、水解肽鏈等；生物化學(xué)法利用蛋白酶選擇性分割pro，采用基因重組技術(shù)或人工合成DNA，改造蛋白，甚至合成新的pro。3、pro的結(jié)構(gòu)修飾第12頁(yè)/共24頁(yè)四、pro工程的產(chǎn)生與發(fā)展

1、pro工程與其他技術(shù)相互滲透（1）pro工程與發(fā)酵工程發(fā)酵工程可以利用基因技術(shù)和細(xì)胞雜交技術(shù)選育出一大批生長(zhǎng)速度快、代謝能力強(qiáng)、易于大量表達(dá)外源產(chǎn)物的新菌種，可為pro工程提供優(yōu)良穩(wěn)定的工程菌株，并可為pro工程中前期材料的制備等奠定重要基礎(chǔ)。第13頁(yè)/共24頁(yè)（2）pro工程與基因工程

pro工程是從DNA水平改變基因入手，通過體外重組技術(shù)改造pro或設(shè)計(jì)合成具有特定功能新pro的新興研究領(lǐng)域，也就是說(shuō)pro的改造通常需要經(jīng)過周密的分子設(shè)計(jì)，進(jìn)而依賴基因工程獲得突變型pro。目前，基因工程已為實(shí)現(xiàn)pro工程提供了基因克隆、表達(dá)、突變及活性檢測(cè)等關(guān)鍵技術(shù)。第14頁(yè)/共24頁(yè)（3）pro工程與細(xì)胞工程細(xì)胞工程是指以細(xì)胞為單位，在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上有目的地進(jìn)行遺傳操作，通過細(xì)胞融合、核移植等方法，培養(yǎng)出人們需要的新物種，克服了源遠(yuǎn)雜交的局限性。目前，細(xì)胞工程技術(shù)已為pro工程提供了改良性狀的微生物細(xì)胞以及穩(wěn)定的動(dòng)植物細(xì)胞系，以便更好的生產(chǎn)pro；另外，細(xì)胞工程可通過細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變生物的遺傳性狀或?qū)崿F(xiàn)新型生物的構(gòu)建，進(jìn)而為pro的生產(chǎn)提供更多良好的載體。第15頁(yè)/共24頁(yè)（4）pro工程與酶工程由于大部分酶的化學(xué)本質(zhì)是pro，因此酶工程與pro工程的發(fā)展密不可分。第16頁(yè)/共24頁(yè)（5）pro工程與生物信息技術(shù)利用生物信息學(xué)可以進(jìn)行pro結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，其目的就是利用已知的一級(jí)序列來(lái)構(gòu)建pro的立體結(jié)構(gòu)模型。第17頁(yè)/共24頁(yè)2、pro工程的發(fā)展簡(jiǎn)史1926年，Sumner從刀豆中提純了脲酶，首次證明酶的本質(zhì)是pro。1932年，英國(guó)化學(xué)家Krebs等提出合成尿素的鳥氨酸循環(huán)多酶反應(yīng)途徑。1937年，Krebs公布了三羧酸循環(huán)的研究成果。1940年，德國(guó)生化學(xué)家Embclen和Megerbof公布了糖酵解途徑。隨后，脂肪酸氧化和核苷酸代謝途徑也相繼被闡明。同時(shí)期，我國(guó)生物化學(xué)家吳憲等提出pro變性學(xué)說(shuō)。第18頁(yè)/共24頁(yè)1953年，英國(guó)生物化學(xué)家桑格破譯出由17種51個(gè)aa組成的牛胰島素兩條多肽鏈的全部結(jié)構(gòu)。1965年，我國(guó)首先在世界上成功人工合成了具有天然生物活力的pro——結(jié)晶牛胰島素。1975年，O’Farrel建立了雙向電泳（2-DE）技術(shù)，可以用于組織與細(xì)胞中大規(guī)模pro的分離。20世紀(jì)80年代末期，Hillenkamp發(fā)展了激光解吸質(zhì)譜，F(xiàn)enn設(shè)計(jì)了電噴霧質(zhì)譜，可以高效、精確地測(cè)量生物大分子的質(zhì)量并測(cè)定部分序列，進(jìn)而用于數(shù)據(jù)庫(kù)的檢測(cè)；Mann通過建立“肽指紋圖譜與肽序列標(biāo)簽”等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)譜準(zhǔn)確、快速、自動(dòng)化和大規(guī)模鑒定pro的飛躍。第19頁(yè)/共24頁(yè)1982年，Winter等首次報(bào)道通過基因定點(diǎn)誘變獲得改性。1983年，Ulmer在《Science》上發(fā)表了ProteinEngineering的專論，標(biāo)志著pro工程的正式誕生。1982年~1985年，F(xiàn)orsht等對(duì)酪氨酰tRNA合成酶的分子進(jìn)行了改造，根據(jù)X射線衍射實(shí)測(cè)該酶與底物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)改變與底物結(jié)合的aa殘基，還用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機(jī)制，這就是最早的pro工程。第20頁(yè)/共24頁(yè)1984年，Perry通過將溶菌酶中Ile3改成Cys3，并進(jìn)一步氧化成Cys3-Cys97二硫鍵，提高了酶的熱穩(wěn)定性，顯著改進(jìn)了溶菌酶在食品工業(yè)的應(yīng)用價(jià)值。1987年，F(xiàn)orsht將枯草桿菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而導(dǎo)致活性中心His64質(zhì)子pKa從7降到6，使酶在pH=6時(shí)的活力提高10倍。工業(yè)用酶最佳pH的改變預(yù)示著其可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。第21頁(yè)/共24頁(yè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系

其關(guān)系是相互的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的分子基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征決定了蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。