生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座

生殖細(xì)胞中細(xì)胞凋亡碩士高級生化專題匯報生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第1頁目錄一、細(xì)胞凋亡概念三、雄性生殖細(xì)胞凋亡摘要二、細(xì)胞凋亡路徑四、雌性生殖細(xì)胞凋亡摘要五、生殖細(xì)胞凋亡現(xiàn)象個案展示六、細(xì)胞凋亡中相關(guān)蛋白七、細(xì)胞凋亡機(jī)理八、凋亡誘導(dǎo)因子生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第2頁一、細(xì)胞凋亡概念：生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第3頁

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是一個由基因控制細(xì)胞自主性死亡方式,是一個主動、程序性、細(xì)胞固有生物學(xué)過程,又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD);是1972年由Kerr教授依據(jù)形態(tài)學(xué)特征首先提出[1]。細(xì)胞凋亡與組織器官發(fā)育,機(jī)體正常生理活動維持,一些疾病發(fā)生以及細(xì)胞惡變等過程均相關(guān)[2]概念:生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第4頁二、細(xì)胞凋亡路徑（一）、細(xì)胞凋亡兩條主要路徑1、死亡受體介導(dǎo)凋亡路徑或外在路徑(deathreceptor-mediatedpathway或extrinsicpathway)2、線粒體凋亡路徑或內(nèi)在路徑(mitochondrialpathway或intrinsicpathway)。即使兩條凋亡通路上游事件(up-streamactivation)不一樣[2],不過它們最終都要激活共同凋亡效應(yīng)物,即特異胱冬酶(caspase)。細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控,在正常細(xì)胞中胱冬酶處于非活化酶原狀態(tài),凋亡程序一旦開始,胱冬酶被活化,隨即發(fā)生凋亡蛋白酶層疊級聯(lián)反應(yīng),引發(fā)不可逆凋亡。（二）、細(xì)胞凋亡其它路徑1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡路徑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究較多有兩種機(jī)制,為非折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinreaction,UPR)和鈣離子起始信號(caiciumsignallng)生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第5頁哺乳動物睪丸內(nèi)精子發(fā)生是一個復(fù)雜而精細(xì)過程,這一過程需要許多精密調(diào)整機(jī)制在其中起調(diào)控作用,凋亡便是其中一個調(diào)整機(jī)制。正常精子發(fā)生過程中就存在自發(fā)生殖細(xì)胞凋亡。睪丸內(nèi)生殖細(xì)胞凋亡可排除受到損傷或含有畸形染色體生殖細(xì)胞,以確保遺傳信息準(zhǔn)確傳遞;并可將生殖細(xì)胞數(shù)量控制在支持細(xì)胞能夠承受范圍內(nèi),以確保這些生殖細(xì)胞得到足夠營養(yǎng)和支持。然而過分凋亡會造成生殖細(xì)胞數(shù)量降低,使生成精子數(shù)量降低,機(jī)體生育力下降。三、雄性生殖細(xì)胞凋亡——睪丸生精細(xì)胞凋亡影響原因生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第6頁在正常精子發(fā)生及成熟過程中,廣泛存在生精細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,生精細(xì)胞凋亡對生精過程含有主要意義。機(jī)體經(jīng)過凋亡來維持生精小管內(nèi)環(huán)境中精子數(shù)量平衡,這對于維持成熟精子數(shù)量,確保精子正常發(fā)育和成熟,確保睪丸發(fā)揮正常生理機(jī)能是必需。但在實際中,生精細(xì)胞凋亡受許多內(nèi)在和外在原因影響。在正常精子發(fā)生及成熟過程中,廣泛存在生精細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,生精細(xì)胞凋亡對生精過程含有主要意義。機(jī)體經(jīng)過凋亡來維持生精小管內(nèi)環(huán)境中精子數(shù)量平衡,這對于維持成熟精子數(shù)量,確保精子正常發(fā)育和成熟,確保睪丸發(fā)揮正常生理機(jī)能是必需。但在實際中,生精細(xì)胞凋亡受許多內(nèi)在和外在原因影響。1激素影響（卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)）試驗研究表明,激素改變與生殖細(xì)胞凋亡相關(guān)。睪丸內(nèi)睪酮主要是由間質(zhì)細(xì)胞合成份泌,所以間質(zhì)細(xì)胞破壞或損傷時生精細(xì)胞凋亡增加,且凋亡發(fā)生與睪酮分泌有顯著依賴性,

出現(xiàn)凋亡主要是粗線期、細(xì)線前期精母細(xì)胞。另有研究表明,睪酮對生精細(xì)胞凋亡調(diào)控作用還受到其它激素和物理性原因影響。FSH對生精細(xì)胞凋亡調(diào)控可能與支持細(xì)胞和睪酮相關(guān),FSH可經(jīng)過支持細(xì)胞調(diào)控生殖細(xì)胞凋亡,FSH被拮抗或其水平下降,都能使生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡,睪酮可增強(qiáng)FSH對生精細(xì)胞調(diào)控作用。LH水平下降而引發(fā)睪酮下降時則凋亡顯著,試驗研究中發(fā)覺生殖細(xì)胞凋亡會隨血清中睪酮水平下降而增加,生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第7頁2基因調(diào)控生精細(xì)胞凋亡主要影響原因是基因調(diào)控。2.1P53P53是一個抑癌基因,與細(xì)胞生長、分化和死亡親密相關(guān),正常P53基因含有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用,而突變型P53基因則抑制細(xì)胞凋亡。P53在睪丸中表示量很高,尤其是在分裂前細(xì)線期到粗線期精母細(xì)胞。有研究表明,缺乏P53表示生殖細(xì)胞不易凋亡,是因為缺乏P53粗線期精母細(xì)胞不能對減數(shù)分裂DNA重組中錯誤進(jìn)行修復(fù),細(xì)胞不能深入發(fā)展進(jìn)行減數(shù)分裂而阻止了凋亡發(fā)生。已經(jīng)有研究表明高溫可經(jīng)過P53路徑誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡,造成精子生成量降低。2.2Bcl-2Bcl-2為細(xì)胞內(nèi)主要凋亡調(diào)整因子,Bcl-2存在于動物各種正常組織內(nèi),Bcl-2對凋亡含有抑制作用,它不能促進(jìn)細(xì)胞增殖,但能延長細(xì)胞生命期限。哺乳動物細(xì)胞凋亡包括內(nèi)在和外在2個路徑,在內(nèi)在路徑中,線粒體依賴路徑是熱誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞凋亡關(guān)鍵路徑,而Bcl2家族蛋白包含Bax、Bcl2等在此路徑中起著主要作用。2.3Fas/FasL系統(tǒng)Miura等研究發(fā)覺將小鼠睪丸和尾巴浸在43℃恒溫水浴中15min后,生精細(xì)胞凋亡率顯著增加,主要是由Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)。還有研究發(fā)覺含有支持細(xì)胞毒性物質(zhì)是經(jīng)過Fas/FasL誘發(fā)睪丸生殖細(xì)胞凋亡。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第8頁2.4hsp基因族表示蛋白hsp是一組廣泛存在于原核和真核生物中高度保守蛋白質(zhì),各類在小鼠等各種哺乳動物正常睪丸組織中有表示,作為生精細(xì)胞或體細(xì)胞細(xì)胞成份存在,而可經(jīng)過cmyc、p53、Bcl2等基因抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為HSP70-2基因突變可使減數(shù)分裂后精子細(xì)胞缺失并造成不育。2.5C-myc基因在相關(guān)轉(zhuǎn)基因大鼠研究中發(fā)覺,C-myc基因過分表示能夠造成雄性大鼠不育,而高能微波照射后可引發(fā)大鼠生精細(xì)胞C-myc蛋白表示,表明C-myc可能是高能微波照射造成凋亡誘導(dǎo)原因。C-myc基因能夠開啟細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞分化,調(diào)整細(xì)胞周期及調(diào)控細(xì)胞凋亡,它表示既可引發(fā)細(xì)胞增殖,又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這兩種應(yīng)答以何種為主取決于一些關(guān)鍵因子存在是否。有學(xué)者在轉(zhuǎn)基因大鼠研究中發(fā)覺,C-myc過分表示能夠造成雄性大鼠不育。另外,CREM基因、線粒體相關(guān)基因、iNOS基因等都與細(xì)胞凋亡相關(guān),腫瘤抑制基因Smad4與細(xì)胞凋亡親密相關(guān),Narula等發(fā)覺,Smad4在轉(zhuǎn)基因小鼠中過表示會造成生殖細(xì)胞凋亡,精子發(fā)生停頓以及生精小管退化現(xiàn)象。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第9頁3其它原因影響3.1理化原因一些化學(xué)原因可直接或間接影響生殖細(xì)胞凋亡。環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和長春新鹼都是臨床慣用抗癌藥,他們均可引發(fā)大鼠和小鼠生精細(xì)胞凋亡。睪丸生精細(xì)胞凋亡對電離輻射敏感,很低劑量照射就可引發(fā)小鼠生精細(xì)胞凋亡增加。3.2光、熱刺激在對倉鼠研究中發(fā)覺,睪丸細(xì)胞凋亡是因為暴露于短白天而引發(fā)睪丸退化,而光刺激睪丸生長又是與睪丸細(xì)胞凋亡快速停頓相聯(lián)絡(luò),盡管光介導(dǎo)睪丸細(xì)胞增殖也可能發(fā)生,不過當(dāng)前發(fā)覺睪丸退化及恢復(fù)過程中睪丸細(xì)胞凋亡起主要作用。4展望睪丸生精細(xì)胞凋亡已經(jīng)引發(fā)了國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注,當(dāng)前相關(guān)睪丸生精細(xì)胞凋亡研究尚處于起步階段。相關(guān)生殖細(xì)胞凋亡多數(shù)研究是建立在動物試驗基礎(chǔ)上,從細(xì)胞和分子水平說明動物和人睪丸生殖細(xì)胞凋亡及調(diào)控機(jī)制研究較少。伴隨對生殖細(xì)胞凋亡深入研究,首先可為男性生育力降低提供更多治療和對策,探討男性避孕方法和機(jī)制,最終在細(xì)胞和分子水平為臨床男性生殖健康提供理論依據(jù)。另首先,為制訂環(huán)境毒物安全接觸限量提供科學(xué)依據(jù)。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第10頁四、雌性生殖細(xì)胞中細(xì)胞凋亡牛卵子發(fā)生過程中卵母細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)理就雌性生殖系而言,細(xì)胞凋亡是其發(fā)育過程中一個主要組成部分。在母牛中,超出99.9%雌性生殖細(xì)胞都會在卵子發(fā)生不一樣階段發(fā)生凋亡。本文主要綜述了牛卵子發(fā)生過程中卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象、凋亡分子機(jī)理等,同時還探討了卵母細(xì)胞凋亡路徑。有資料表明細(xì)胞凋亡對于卵巢中生殖細(xì)胞降低、卵泡閉鎖和黃體溶解都起著主要作用。1卵子發(fā)生過程中卵母細(xì)胞凋亡已經(jīng)有許多試驗證實[2],母牛卵母細(xì)胞在發(fā)生過程中大量死亡或丟失是屬于細(xì)胞凋亡。當(dāng)前認(rèn)為,原始卵泡、初級卵泡和腔前卵泡閉鎖主要是由卵細(xì)胞凋亡引發(fā),而卵泡發(fā)育后期,除源于卵母細(xì)胞本身凋亡引發(fā)以外,也有因為包圍卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞凋亡引發(fā),如有腔卵泡及排卵前成熟卵泡閉鎖即是由卵泡中顆粒細(xì)胞(granulosecells,GCs)凋亡引發(fā),這是一個由內(nèi)分泌激素控制凋亡過程。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第11頁2卵母細(xì)胞凋亡分子機(jī)理當(dāng)前人們對細(xì)胞凋亡分子機(jī)理已掌握得比較清楚,各種不一樣調(diào)控蛋白,如caspases(凋亡酶)、Bcl-2家族、線粒體釋放促凋亡因子和Apaf-21等是怎樣決定細(xì)胞命運分子框架都已被研究得很透徹。在胚胎性腺中存在著死亡信號(TNF-2α、Fas配體等)和存活信號(LIF、kit配體等)。在這些信號作用下,凋亡主要經(jīng)過caspases、Bcl-2等蛋白質(zhì)家族相互作用來實現(xiàn)。另外,組織型纖溶酶激活因子(tPA)蛋白介導(dǎo)蛋白水解作用可能參加了卵母細(xì)胞本身瓦解和去除過程。在很多中途發(fā)生閉鎖卵泡中,卵母細(xì)胞中tPA活性很高,而健康卵泡卵母細(xì)胞則tPA活性很低。tPA與顆粒細(xì)胞中表示抑制素α相互作用,可能對卵泡破裂、成熟卵子釋放和未成熟卵子閉鎖均起作用。3卵母細(xì)胞凋亡路徑細(xì)胞凋亡受體內(nèi)外各種原因影響,但各種原因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否,取決于細(xì)胞本身遺傳特征。細(xì)胞類型不一樣,其影響原因亦不相同。類型不一樣,其影響原因亦不相同。當(dāng)母牛卵母細(xì)胞不能從環(huán)境中得到足夠存活因子時會造成細(xì)胞凋亡;當(dāng)細(xì)胞減數(shù)分裂時發(fā)生配對錯誤或重組異常配子時,凋亡能除去有缺點配子,而保留能正常進(jìn)行減數(shù)分裂配子,這是體內(nèi)質(zhì)量監(jiān)督機(jī)制;在配子發(fā)生期間,細(xì)胞還經(jīng)過“自我犧牲(利他性)”凋亡來實現(xiàn)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟。激素刺激也是發(fā)生卵母細(xì)胞凋亡根本原因,不一樣激素經(jīng)過不一樣第二信使路徑調(diào)整生殖細(xì)胞凋亡。凋亡誘導(dǎo)基因及凋亡抑制基因表示產(chǎn)物經(jīng)過協(xié)同或拮抗作用維持一個動態(tài)平衡,控制卵母細(xì)胞凋亡。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第12頁細(xì)胞凋亡開啟是細(xì)胞在感受到對應(yīng)信號刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)開啟或關(guān)閉,不一樣外界原因開啟凋亡方式不一樣,所引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同[5]。細(xì)胞凋亡路徑主要有兩條,一條是經(jīng)過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)凋亡酶(caspase);一條是經(jīng)過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化caspase可將細(xì)胞內(nèi)主要蛋白降解,引發(fā)細(xì)胞凋亡。3.1膜受體通路這是一條基本經(jīng)過DD和FADD細(xì)胞凋亡調(diào)控路徑。細(xì)胞表面與凋亡相關(guān)受體屬于腫瘤壞死因子受體(TNFreceptor,TNFR)超家族,胞外有一個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域,胞漿區(qū)有一由同源氨基酸殘基組成結(jié)構(gòu),有蛋白水解功效,稱“死亡區(qū)域”(deathdomain,DD)。已知死亡受體有TNFR-1、Fas、DR3、DR4和DR55種。前3種受體對應(yīng)配體為TNF、FasL和APO-3L,后兩種均為APO-2L即TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNFrelatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)。在這些死亡受體中最經(jīng)典是Fas和TNFRs。以Fas-FasL死亡通路為例,Fas是一個跨膜蛋白,含有三個富含半胱氨酸胞外區(qū)和一個DD胞內(nèi)區(qū),它與FasL結(jié)合能夠開啟凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)細(xì)胞凋亡。FasL與Fas結(jié)合能夠造成Fas胞內(nèi)死亡域形成三聚體而活化,并引發(fā)與之結(jié)合FADD構(gòu)象改變,使caspase-8前體集聚、斷裂和激活,產(chǎn)生有活性caspase-8,從而激發(fā)一系列下游caspase級聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)細(xì)胞凋亡。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第13頁3.2線粒體通路線粒體是細(xì)胞生命活動控制中心,它不但是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化中心,而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。當(dāng)Fas配體與Fas受體結(jié)合后,可激活caspase-8,引發(fā)Bcl-2家族中促凋亡組員Bid裂解,破壞線粒體,釋放細(xì)胞色素C等各種凋亡發(fā)生因子。釋放到細(xì)胞漿細(xì)胞色素C

在dATP存在條件下與凋亡激活因子1(apoptoticproteaseactivatingfactor1,Apaf-1)結(jié)合,使其形成多聚體,并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體,此時caspase-9被激活。被激活caspase-9能激活其它凋亡酶如caspase-3

等,引發(fā)凋亡酶級聯(lián)反應(yīng),從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。另外,線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子,如AIF等參加激活凋亡酶?？梢?細(xì)胞凋亡小體相關(guān)組分存在于正常細(xì)胞不一樣部位,促凋亡因子能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體形成。很顯然,細(xì)胞色素C從線粒體釋放調(diào)整是細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究關(guān)鍵問題[7]。當(dāng)前普遍認(rèn)為細(xì)胞色素是經(jīng)過線粒體PT孔或Bcl-2家族組員形成線粒體跨膜通道釋放到細(xì)胞質(zhì)中。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第14頁五、生殖細(xì)胞中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象個案展示有研究表明[1]在精子發(fā)生過程中,機(jī)體經(jīng)過生殖細(xì)胞凋亡來去除受到損傷或染色體畸形生精細(xì)胞,嚴(yán)格控制生精細(xì)胞與支持細(xì)胞最適數(shù)目比,確保正常數(shù)量和質(zhì)量精子分化成熟。所以,生精細(xì)胞凋亡紊亂將有礙于精子發(fā)生,成為男性原發(fā)不育主要原因之一。本研究采取TUNEL及免疫組化技術(shù)檢測男性原發(fā)不育患者生精細(xì)胞凋亡指數(shù)及凋亡相關(guān)基因Caspase-3表示,探討Caspase-3對生精細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制。五-1、Caspase-3與生精細(xì)胞凋亡關(guān)系研究生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第15頁細(xì)胞凋亡受促凋亡基因和抑凋亡基因雙重調(diào)控,二者通過死亡受體路徑或線粒體路徑激活Caspase蛋白酶,并作用到下游酶切底物,進(jìn)而產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng),最終造成細(xì)胞凋亡。在Caspase級聯(lián)反應(yīng)中,半胱氨酸蛋白酶Caspase-3是下游一個主要公共凋亡效應(yīng)因子,在各種原因啟發(fā)凋亡程序中起最終樞紐作用。有學(xué)者[5,6]在分析男性不育精液時,發(fā)覺精子數(shù)量降低與Caspase-3活性增加親密相關(guān),并認(rèn)為Caspase-3參加生精上皮調(diào)控、精子分化和睪丸成熟。本研究經(jīng)過對睪丸組織研究發(fā)覺,男性不育患者生精細(xì)胞Caspase-3陽性率顯著高于正常對照組(P﹤0.01),深入證實并支持上述觀點。結(jié)合Caspase-3在凋亡調(diào)控中作用地位,認(rèn)為正確控制Caspase-3活性可確保正常數(shù)量精子發(fā)育成熟,并減輕男性原發(fā)不育中生精細(xì)胞數(shù)量過低異常表現(xiàn)。因為生精細(xì)胞凋亡也是精子正常發(fā)生過程中一個必不可少調(diào)整機(jī)制。所以,在機(jī)體發(fā)育成熟不一樣階段,選擇恰當(dāng)時機(jī)和適當(dāng)程度是有效控制生精細(xì)胞凋亡關(guān)鍵,也是今后研究方向。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第16頁五-2、丙烯酰胺致大鼠睪丸生殖細(xì)胞DNA損傷與P53蛋白表示

丙烯酰胺(acrylamide,AA)是一個高水溶性小分子有機(jī)物,可經(jīng)皮快速吸收。當(dāng)前,在工業(yè)加工中暴露于AA工人數(shù)以萬計,分子生物學(xué)試驗室科研人員也有潛在接觸。最近又在各種食品中發(fā)覺丙烯酰胺存在[1]。研究表明AA在大、小鼠體內(nèi)經(jīng)過細(xì)胞色素P4502El(CYP2EI)代謝為環(huán)氧丙酰胺,經(jīng)過這種高活性環(huán)氧化物而產(chǎn)生基因毒性[2]。p53蛋白在監(jiān)控基因組完整性上是一個關(guān)鍵調(diào)整因子,參加各種細(xì)胞功效,可降低基因突變積累并具抑制細(xì)胞癌變能力。p53在DNA切除修復(fù)過程中起主要作用,它在核苷酸和堿基切除修復(fù)過程中起轉(zhuǎn)錄因子和修復(fù)復(fù)合物組分作用。表明p53蛋白在AA誘導(dǎo)下表示增多,參加細(xì)胞凋亡過程。合理解釋是AA造成DNA損傷激活了p53表示,從而引導(dǎo)損傷細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)路徑或凋亡。p53主要參加調(diào)控DNA復(fù)制和修復(fù),另外p53蛋白是凋亡通路組成部分,可修復(fù)DNA加合物等各種DNA損傷,從而降低自發(fā)和化學(xué)物誘導(dǎo)DNA損傷[5]。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第17頁五-3、哺乳動物顆粒細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展

動物卵巢上有許多原始卵泡,但只有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵,大約99%卵泡發(fā)生閉鎖(follicleatresia)。卵泡閉鎖是卵泡從發(fā)育到排卵前所發(fā)生退化并最終被去除生理現(xiàn)象,主要經(jīng)過細(xì)胞凋亡(apoptosis)而實現(xiàn),它是由基因控制程序化死亡,對維持卵巢內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)主要,其中顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖主要機(jī)制。在發(fā)育卵泡中,假如10%以上顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡,那么該卵泡注定發(fā)生閉鎖[1]細(xì)胞凋亡是雌性生殖系發(fā)育過程中一個主要組成部分,在哺乳動物中,超出99%雌性生殖細(xì)胞都會在卵子發(fā)生不一樣階段發(fā)生凋亡。當(dāng)前,在顆粒細(xì)胞凋亡過程中最少發(fā)覺5個配體受體系統(tǒng):TNFa和TNF受體系統(tǒng),Fas配體受體系統(tǒng),TRAIL和TRAIL受體系統(tǒng),APO23配體受體系統(tǒng),PFG25配體受體系統(tǒng),而且發(fā)覺顆粒細(xì)胞凋亡屬于依賴于線粒體凋亡信號傳導(dǎo)凋亡路徑。顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)整,同其它細(xì)胞凋亡現(xiàn)有相同之處,同時也含有其特有調(diào)控原因和調(diào)控模式。凋亡可由影響卵泡發(fā)育其它原因和信號傳導(dǎo)機(jī)制來引發(fā),也受旁分泌和自分泌及死亡基因和腫瘤基因之間相互影響,這些可能是決定顆粒細(xì)胞命運主要原因[4]。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第18頁五-4、生殖細(xì)胞凋亡過程中外源性一氧化氮參加及其效應(yīng)*一氧化氮是體內(nèi)信息分子、效應(yīng)分子和細(xì)胞毒性因子，它在細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞防御和損害過程中可經(jīng)過不一樣路徑誘導(dǎo)眾多細(xì)胞凋亡[1-4]。一氧化氮合酶廣泛存在于睪丸、附睪、輸精管、精囊腺等生殖系統(tǒng)中，其合成一氧化氮在生殖不一樣階段對生育進(jìn)行調(diào)整，參加精子發(fā)生、成熟、獲能及生殖細(xì)胞凋亡[5-8]。為探討男性不育發(fā)病機(jī)制，本文以可釋放自由基一氧化氮硝普鈉作為一氧化氮供體觀察其對大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡作用，為男性不育診療治療提供理論和試驗依據(jù)。一氧化氮是含有生物學(xué)活性自由基，研究表明在哺乳動物生殖系統(tǒng)中廣泛存在，對生殖細(xì)胞發(fā)生、成熟起主要作用，還可誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡[5，13，14]。一氧化氮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡毒性作用機(jī)制，可能在于其能和蛋白質(zhì)巰基及鐵硫蛋白相互反應(yīng)或直接損傷細(xì)胞DNA[20]。使核內(nèi)DNA斷成片段，而漿內(nèi)DNA未受破壞，這一過程是由受體介導(dǎo)第二信號所致。還有體內(nèi)產(chǎn)生氧自由基能與一氧化氮快速反應(yīng)，生成細(xì)胞毒性更大過氧化亞硝基自由基（ONOO-），ONOO-對生殖細(xì)胞含有損傷作用，從而造成睪丸生殖細(xì)胞發(fā)生紊亂，凋亡增加[13，21，22]，提醒一氧化氮或其代謝產(chǎn)物可引發(fā)睪丸生殖細(xì)胞凋亡增加，從而為男性不育診治提供了新路徑。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第19頁五-K5、雌激素抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子雌激素是一個類固醇性激素，主要生理功效是促進(jìn)女性生殖系統(tǒng)各個器官發(fā)育和維持女性第二性征。然而，越來越多研究發(fā)覺，雌激素還含有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。雌激素抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡與其作用于以下各種因子相關(guān)，如Bcl-2家族、Ca2+、胱天蛋白酶(caspase)家族，以及胰島素樣生長因子-駁取Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因研究中研究得最多一類蛋白質(zhì)，是內(nèi)源性凋亡路徑關(guān)鍵性調(diào)控分子。在哺乳動物發(fā)覺Bcl-2家族組員共有15種[4]，依據(jù)家族組員結(jié)構(gòu)及其在凋亡中作用被分成3個亞家族：(1)Bcl-2亞家族，含有抑凋亡作用，包含Bcl-2、Bclxl、Bcl-w、Mcl-1和A1；(2)Bax亞家族，含有促凋亡作用，包含Bax、Bak和Bok；(3)BH3亞家族，含有促凋亡作用，包含Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk、BNIP3和BimL。大量研究發(fā)覺，雌激素能夠促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl在中樞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)高表示，從而抑制由腦缺血以及b淀粉樣蛋白(b-amloid，Ab)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第20頁五-K6、低氧對大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡影響B(tài)ax和Bcl22在睪丸生殖細(xì)胞凋亡中含有主要作用[527]。以往研究發(fā)覺高原低氧引發(fā)精液中精子數(shù)量下降,睪丸內(nèi)精子發(fā)生過程受到抑制[123]。這與精子在其發(fā)生過程中輕易受到低氧脅迫相關(guān),是由睪丸生殖細(xì)胞高代謝與氧供距離相對較長特點所決定。另外,機(jī)體處于低氧狀態(tài)時,往往優(yōu)先保障心腦等主要器官,而睪丸血供卻顯著下降,從而加重了生殖細(xì)胞缺氧,使生殖細(xì)胞輕易受到損傷[11]。Bax和Bcl22是主要凋亡調(diào)控蛋白。Bax/Bcl22路徑在精子發(fā)生過程中有主要調(diào)整作用。Bax是A型精原細(xì)胞在發(fā)育過程中正常死亡所必需,尤其是A2、A3和A4精原細(xì)胞。Bcl22經(jīng)過與Bax結(jié)合而發(fā)揮抗凋亡作用。二者相對水平?jīng)Q定了細(xì)胞命運。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第21頁五-K7、細(xì)胞凋亡因子survivin與男性不育癥survivin是一個細(xì)胞凋亡抑制蛋白,它在細(xì)胞分裂時調(diào)控細(xì)胞凋亡,不但在人類腫瘤組織中普遍過分表示,而且表示于人類正常睪丸組織中。不停有研究顯示survivin是精子發(fā)生過程中一個潛在分子標(biāo)志物,它表示在生精障礙患者中有顯著改變。

survivin經(jīng)過干擾caspase活性來妨礙有絲分裂中細(xì)胞凋亡。caspase是一個半胱氨酸蛋白酶,在細(xì)胞凋亡分子機(jī)制中作為主要效應(yīng)子執(zhí)行凋亡。survivin能否與caspase直接連接還未得到明確證實。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第22頁六、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

細(xì)胞凋亡是個體發(fā)育過程中由一系列蛋白調(diào)控細(xì)胞主動死亡過程。其中,bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是主要凋亡調(diào)整因子,在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)絡(luò),相互作用,從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。caspase家族蛋白caspase是半胱氨酸基天冬氨酸-特異性蛋白酶(cystei-nylaspartatespecificproteinase)即半胱氨酸天冬氨酸酶縮寫。它們是一組存在于胞漿中半胱氨酸蛋白酶,其共同特點是特異性斷開天冬氨酸殘基后肽鍵。到當(dāng)前為止,在小鼠和人類中,已經(jīng)發(fā)覺caspase家族最少有14個組員。細(xì)胞中合成caspase以無活性酶原狀態(tài)存在,經(jīng)活化后方能執(zhí)行其功效。Bcl-2家族蛋白Bcl-2被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白家族中最主要調(diào)控蛋白,和Bcl-2,Bax,Bad,Bak等共同組成了Bcl-2蛋白家族,Bcl-2功效受其蛋白產(chǎn)物Bax和Bcl-xl蛋白調(diào)整。生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡專家講座第23頁3、p53蛋白腫瘤抑制蛋白p53在維持蛋白組完整性中起著主要作用。p53作為一個轉(zhuǎn)錄因子對DNA損傷做出反應(yīng),并誘導(dǎo)下游蛋白如p21,Mdm2和Bax表示,這些下游蛋白能夠調(diào)整細(xì)胞周期和凋亡。正常p53在細(xì)胞里功效有各種,但當(dāng)前研究最多有兩種,一個是抑制細(xì)胞分裂,讓其停留在細(xì)胞周期Gl期,另一個是使細(xì)胞凋亡,此兩種功效與p53轉(zhuǎn)錄能力都有一定程度聯(lián)絡(luò)。p53介導(dǎo)凋亡機(jī)制可能是經(jīng)過以下幾點:1)在凋亡過程中線粒體膜失去完整性,接著細(xì)胞色素C釋放入胞漿,引發(fā)caspase斷裂激活。4、

survivin蛋白凋亡抑制蛋白(IAP)是凋亡抑制蛋白家族之一,survivin是新