基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用

基因修飾技術(shù)在人源化肝臟小鼠模型中應(yīng)用基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第1頁早在17世紀(jì)動物試驗(yàn)就已經(jīng)出現(xiàn)了。當(dāng)前試驗(yàn)動物廣泛應(yīng)用于生理學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科教學(xué)與研究，以及食品、化裝品、生物制品、工業(yè)產(chǎn)品等安全性、毒性和效力等方面試驗(yàn)和檢測，含有主要價(jià)值和作用。試驗(yàn)用動物基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第2頁種屬差異動物基因組人類基因組代謝、免疫相關(guān)人類毒性基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第3頁

肝臟是人體最主要代謝器官，也是出現(xiàn)受試人員中毒時(shí)最常見、表現(xiàn)最顯著、影響最嚴(yán)重毒性靶器官。另據(jù)報(bào)導(dǎo)，每年臨床發(fā)生肝毒性損傷病例亦非常多。藥物引發(fā)肝損傷占全部中毒事件20%－50%，暴發(fā)性肝衰竭可達(dá)15%－30%。藥品性肝損害基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第4頁非阿尿苷事件回顧非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷類似物，其前期試驗(yàn)藥效顯著，結(jié)果良好。而1993年15名受試者加大劑量（0.1or0.25mg/kg/d)）二期臨床試驗(yàn)中，前8周療效顯著，而13周時(shí)7名受試者出現(xiàn)肝衰竭、脾衰竭、乳酸中毒，其中5名不治身亡。基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第5頁動物試驗(yàn)非阿尿苷最大耐受劑量小鼠50mg/kg/d90d大鼠500mg/kg/d30d比格犬3mg/kd/d90d食蟹猴25mg/kg/d30d小鼠給藥劑量到達(dá)250mg/kg/d（人類劑量1000倍）時(shí)，50只小鼠僅有4只死于腎衰竭。大鼠劑量達(dá)510mg/kg/d（人類劑量倍），連續(xù)給藥70d，全部大鼠ALT、AST均正常?；蛐揎椩谌嗽椿闻K小鼠建模中的應(yīng)用第6頁毒性預(yù)測食品生物制品化妝品藥物試驗(yàn)動物作為預(yù)測工具如不能完全準(zhǔn)確預(yù)測人體可能會出現(xiàn)情況，就如同戰(zhàn)地掃雷，一旦出現(xiàn)誤判，代價(jià)很有可能將是巨大！危險(xiǎn)安全基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第7頁

那么能不能構(gòu)建一個(gè)臨床前更貼近人肝代謝、預(yù)測性更一致性試驗(yàn)動物模型，將可能發(fā)生人類肝毒性提前篩查出來，降低無謂成本，降低臨床損失呢？這將具有極其重大意義和價(jià)值！人源化肝臟小鼠模型由此成為研究熱點(diǎn)基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第8頁分子技術(shù)生物模型臨床應(yīng)用當(dāng)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究模式

基因修飾技術(shù)ES打靶基因修飾技術(shù)TALEN基因修飾技術(shù)CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)TetraOneTM基因修飾技術(shù)基因修飾動物建?；蛐揎椩谌嗽椿闻K小鼠建模中的應(yīng)用第9頁免疫缺點(diǎn)小鼠模型構(gòu)建類別序號名稱基因信息特異性免疫非特異性免疫免疫

缺陷

小鼠1NudeFoxn1nu無胸腺，無T，B↓正常2SCIDPrkdcscid無T，無B正常3NOD-SCIDNOD/Prkdcscid無T，無BNK↓補(bǔ)體↓4Rag2Rag2-/-T、B功效缺失正常5IL2RGIl2rg-/-T、B部分功效缺失NK↓6F344RGRag2-/-/Il2rg-/-T、B功效缺失NK功效缺失7FPGPrkdc-/-/Il2rg-/-T、B功效缺失NK功效缺失8NOGNOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug無T，無BNK、補(bǔ)體功效缺失基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第10頁人源化肝臟小鼠模型構(gòu)建工程基因片段uPA基因片段Fah基因片段HSVtk/GCV自殺系統(tǒng)Tet-on/uPA自殺系統(tǒng)其它移植用人類細(xì)胞肝細(xì)胞造血干細(xì)胞胸腺細(xì)胞其它基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第11頁（1）uPA-Rag2小鼠（Dandri，年，德國）uPA全稱尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子（Urokinase-typePlasminogenActivator），當(dāng)白蛋白開啟uPA基因片段在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)表示時(shí)，纖維蛋白溶酶原會激活纖維蛋白酶，誘發(fā)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生裂解損傷，最終肝細(xì)胞損傷并逐步消亡。Rag2全稱重組激活基因2（Recombination-ActivatingGene2），在VDJ基因重排和淋巴細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵性作用。Rag2-/-小鼠為C57BL/6J品系背景，T、B淋巴細(xì)胞早期發(fā)育嚴(yán)重停滯，外周血沒有成熟循環(huán)T、B淋巴細(xì)胞，非特異性免疫收影響小。Rag2小鼠uPA基因肝細(xì)胞人源化率僅有15%，適合病毒學(xué)研究，但無法滿足代謝研究需求！！基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第12頁（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，年，日本）SCID小鼠全名聯(lián)合缺點(diǎn)免疫小鼠

（severecombinedimmunedeficiency），

其第16對染色體隱性基因突變，純合子

淋巴細(xì)胞抗原受體基因VDJ區(qū)域重組酶活性異常，基因重排無法正常進(jìn)行，影響B(tài)、T細(xì)胞正常分化，外周血白細(xì)胞總數(shù)降低，但粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞正常。uPA-SCID小鼠相比uPA-Rag2小鼠含有更高人源化比率，其肝細(xì)胞替換可達(dá)50%，利用免疫抑制劑后可提升至70%，基本滿足代謝和毒性研究需求，許多學(xué)者利用該模型進(jìn)行了各種藥品研究。SCID小鼠uPA基因基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第13頁連續(xù)性自發(fā)肝損；出血性疾病造成死亡；高血補(bǔ)體濃度（C3）腎??；生殖障礙；移植窗較?。ǔ錾?W內(nèi)移植）；存在非特異性免疫，需藥品抑制免疫。名稱基因信息特異性免疫非特異性免疫肝損傷uPA-SCIDuPA/Prkdcscid無T無B正常uPA（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，年，日本）基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第14頁（3）Fah小鼠（Grompe，1993年，波蘭）Fah全稱延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因（fumarylacetoacetatehydrolase），F(xiàn)ah-/-小鼠酪氨酸代謝受阻，出現(xiàn)Ⅰ型酪氨酸血癥，毒性產(chǎn)物損傷肝、腎。2-硝基-4-三氟甲苯-1,3環(huán)乙烷碘（NTBC）可以抑制酪氨酸降解通路中4-對羥基苯丙酮酸雙氧化酶（4-HPPD）活性，降低毒性代謝產(chǎn)物積聚，起到治療作用。NTBC治療維持含有免疫系統(tǒng)，不適合人源化組織和細(xì)胞移植基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第15頁Fah/nudeFah/Rag1Fah/Nod/Scidll2rg基因是白細(xì)胞介素2受體gamma鏈（Il-2Rγc，又稱CD132)，是具有免疫功效細(xì)胞因子Il-2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21共同受體亞基。

L2rg-/-小鼠機(jī)體免疫功效嚴(yán)重降低，尤其是NK細(xì)胞活性幾乎喪失。名稱基因信息特異性免疫非特異性免疫肝損傷FRGFah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-T、B功效缺失NK↓Fah-/-（4）FRG小鼠（Azuma，年，波蘭）基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第16頁持續(xù)性自發(fā)肝臟；自發(fā)性Ⅰ型酪氨酸血癥突出，易誘發(fā)肝癌；需要藥品NTBC控制肝損傷程度，易對試驗(yàn)結(jié)果造成影響；小鼠存活率不高，喂養(yǎng)時(shí)易死亡。（4）FRG小鼠（Azuma，年，波蘭）FRG小鼠在性狀和效果上都優(yōu)于Fah-/-小鼠，其肝細(xì)胞替換率達(dá)80%以上，后經(jīng)其它學(xué)者改進(jìn)探索，可達(dá)95%左右。該模型應(yīng)用于代謝和病毒等多個(gè)領(lǐng)域研究，有主要意義?；蛐揎椩谌嗽椿闻K小鼠建模中的應(yīng)用第17頁名稱基因信息特異性免疫非特異性免疫NOGNOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug無T，無BNK、補(bǔ)體功效缺失（5）NOG、NSG小鼠（Ito，年，日本）NOG小鼠由日本試驗(yàn)動物研究所Ito培育而成。通過雜交NOD/Scid和Il2rg-/-小鼠而來，其T、B細(xì)胞皆缺失，NK細(xì)胞功效缺點(diǎn)。與NOD/Scid小鼠相比，NOG小鼠人體細(xì)胞和組織移植存活率顯著提升，同時(shí)能夠植入更高百分比正?；虬┳?nèi)祟惣?xì)胞和組織。NOG、NSG是類似并行品系，源于日本為NOG（NOD/Shi-scid/Il-2Rγcnull），源于美國為NSG（NOD/scid/γC?/?/SzJ）。

NOG小鼠在免疫缺點(diǎn)模型、腫瘤模型、異種移植模型、傳染病模型領(lǐng)域有大量應(yīng)用。基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第18頁名稱基因改變特異性免疫非特異性免疫肝損傷TK-NOGTK/NOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug無T，無BNK、補(bǔ)體功效缺失HSVtk/GCV系統(tǒng)（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，年，日本）單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋（HSVtk/GCV）系統(tǒng)是分子生物學(xué)基因修飾技術(shù)中利用十分廣泛自殺系統(tǒng)，GCV本身無毒，不過在轉(zhuǎn)染了HSVtk基因細(xì)胞中可被磷酸化，成為單磷酸鹽，再經(jīng)內(nèi)源性細(xì)胞激酶作用可轉(zhuǎn)化為二磷酸和三磷酸鹽，對細(xì)胞有高毒性?！帷狻釴OGTK-NOG基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第19頁含有些人肝等效酶表示及生物功效；具有較高立體組織結(jié)構(gòu)；人源化程度高（≥90%）；生存率高，移植時(shí)段寬裕，可重復(fù)利用；無需外源性藥物維持性狀；可生殖傳代（雌性可與NOG小鼠生育）；在代謝、毒性、病毒、微生物方面大量應(yīng)用

-，美日有很多研究和數(shù)據(jù)。無商業(yè)化成品供給，國內(nèi)起源受限?。?）TK-NOG小鼠（Hasegawa，年，日本）基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應(yīng)用第20頁（7）uPA-NOG小鼠（Gutti，年，美國）名稱基因改變特異性免疫非特異性免疫肝損傷uPA-NOGuPA/NOD/Shi-scid/Il2rgnull無T，無BNK、補(bǔ)體功效缺失uPAuPA-NOG小鼠是在NOG小鼠基礎(chǔ)上經(jīng)過基因修飾加入uPA基因培育而來，當(dāng)前應(yīng)用相對較少，有報(bào)導(dǎo)文件顯示僅應(yīng)用于病毒學(xué)研究，對肝臟人源化指數(shù)沒有很高要求，僅10%左右。（8）FRGN小鼠（Wilson，