生物技術(shù)-基因工程原理課件 8第八章 DAN序列分析

第八章DAN序列分析2023/4/242Sanger等(1977)提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解法。其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。2023/4/243現(xiàn)行的鏈終止法由加減法序列測定技術(shù)發(fā)展而來的。加減法首次引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進行延伸反應(yīng)、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進展，但加減法仍然太不精確，也太不得法，因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸(ddNTP)作為鏈終止劑，酶法DNA序列測定技術(shù)才得到廣泛應(yīng)用。一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理2023/4/2442‘,3'ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3'羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。誰終止，堿基就是誰!2023/4/245在4組獨立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。2023/4/246熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快2023/4/247引物酶促測序反應(yīng)中利用一個與模板鏈特定序列互補的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物?？梢圆捎媚芘c位于靶DNA兩側(cè)的載體序列相退火的通用引物，而不必取得與未知DNA序列互補的引物。2023/4/248模板兩類DNA可以用作Sanger法測序的模板：純單鏈DNA和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈DNA。通常利用M13噬菌體分離得到的單鏈DNA加熱或堿變性雙鏈DNA作為模板。2023/4/249DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過修飾的、去除了3‘→5’外節(jié)酶活性的T7噬菌體DNA聚合酶測序酶2.0(Sequenase)耐熱DNA聚合物(TaqDNA聚合酶)2023/4/2410標記的dNTP[α-35S]dATP產(chǎn)生β射線，[α-32P]dNTP熒光染料其它2023/4/24112023/4/2412確證性測序確證性測序：確定突變位點、確定克隆的正確性從頭測序：鳥槍法、定向法美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3130xl基因分析儀2023/4/2413測序策略鳥槍法定向測序引物合成2023/