第六章DNA重組與克隆(陜西師范大學(xué)夏海濱)final

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱遺傳重組或或基因重排。重組產(chǎn)物稱為重組體?；蛑亟M主要發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。（形式多樣）重組與進化關(guān)系密切，增加群體的遺傳多樣性，利于突變的優(yōu)化組合。現(xiàn)在是1頁\一共有129頁\編輯于星期二DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)#轉(zhuǎn)座

(transposition)#同源重組

(homologousrecombination)#位點特異的重組(site-specificrecombination)異常重組現(xiàn)在是2頁\一共有129頁\編輯于星期二發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。6.1、同源重組現(xiàn)在是3頁\一共有129頁\編輯于星期二Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA（立體異構(gòu)）④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)現(xiàn)在是4頁\一共有129頁\編輯于星期二片段重組體

：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′現(xiàn)在是5頁\一共有129頁\編輯于星期二

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄現(xiàn)在是6頁\一共有129頁\編輯于星期二片段重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA?，F(xiàn)在是7頁\一共有129頁\編輯于星期二5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′現(xiàn)在是8頁\一共有129頁\編輯于星期二Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄現(xiàn)在是9頁\一共有129頁\編輯于星期二分支移動的過程伴隨著DNA的修復(fù)現(xiàn)在是10頁\一共有129頁\編輯于星期二同源重組是減數(shù)分裂的原因。同源重組是由于堿基間的精確配對實現(xiàn)的現(xiàn)在是11頁\一共有129頁\編輯于星期二異源雙鏈與基因交換同源重組時會產(chǎn)生異源雙鏈，從而發(fā)生基因交換。減數(shù)分裂后分離：（對異源雙鏈區(qū)內(nèi)不配對堿基的修復(fù)而進行的基因校正過程稱作基因轉(zhuǎn)換）基因轉(zhuǎn)換頻率在非對稱異源雙鏈區(qū)較高。基因轉(zhuǎn)換也可以在有絲分裂時姐妹染色體的等位基因間、有絲分裂與減數(shù)分裂時同一條染色單體上非等位重復(fù)基因之間發(fā)生現(xiàn)在是12頁\一共有129頁\編輯于星期二Holliday模型提出了同源重組的基本模式，但對于基因重組具體細節(jié)，異源雙鏈的形成細節(jié)不清楚。在Holliday基礎(chǔ)上提出了單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型，兩個模型的區(qū)別在于解釋重組期間DNA的修復(fù)的具體過程不一樣。有供體受體之分。（受體：發(fā)生鏈斷裂的分子P138-139）現(xiàn)在是13頁\一共有129頁\編輯于星期二細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組低等生物也可以以轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合等多種方式實現(xiàn)細胞間的基因轉(zhuǎn)移。具體方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞融合。外源基因的命運：降解、暫時保留、與內(nèi)源基因置換、整合?，F(xiàn)在是14頁\一共有129頁\編輯于星期二

一、接合作用（conjugation)

當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接 觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至 另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。現(xiàn)在是15頁\一共有129頁\編輯于星期二

F因子編碼表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA轉(zhuǎn)移通道蛋白等、現(xiàn)在是16頁\一共有129頁\編輯于星期二

F因子可以與細菌染色體發(fā)生交叉連接而重組整合入細菌染色體現(xiàn)在是17頁\一共有129頁\編輯于星期二

二、轉(zhuǎn)化作用（transformation)

通過自動獲取或人為地供給外源DNA， 使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細胞高濃度鈣可以誘導(dǎo)感受態(tài)現(xiàn)在是18頁\一共有129頁\編輯于星期二例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取?，F(xiàn)在是19頁\一共有129頁\編輯于星期二

三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction)

當病毒從被感染的細胞（供體） 釋放出來，再次感染另一細胞（受體） 時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間 的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。現(xiàn)在是20頁\一共有129頁\編輯于星期二溶菌感染重組感染細菌噬菌體圖15-3轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過病毒介導(dǎo)發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組現(xiàn)在是21頁\一共有129頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)導(dǎo)：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)現(xiàn)在是22頁\一共有129頁\編輯于星期二*轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。由transformation（轉(zhuǎn)化）和infection（感染）兩詞構(gòu)成。原指將噬菌體、病毒或以其為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入受體細胞的過程。通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導(dǎo)致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染。將任何類型DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞內(nèi)的過程均可叫轉(zhuǎn)染?，F(xiàn)在是23頁\一共有129頁\編輯于星期二細菌的細胞融合由于細胞質(zhì)膜融合導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)移和重組。（原生質(zhì)體融合）現(xiàn)在是24頁\一共有129頁\編輯于星期二細菌的同源重組的酶學(xué)機制1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位點具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈－－－RecA的作用位點RecBCD有固定切割位點原核生物的重組酶學(xué)機制已經(jīng)比較清楚Chi位點出現(xiàn)幾率很高，是RecBCD的靶位點GCTGGTGG現(xiàn)在是25頁\一共有129頁\編輯于星期二3‘?RecBCD的識別和切割位點a、RecBCD結(jié)合在DNA的平頭末端（產(chǎn)生機制不清楚）b、外切、解鏈、移動（ATP）c、兔耳狀loop結(jié)構(gòu)產(chǎn)生再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop單鏈區(qū)的

chi位點3‘方4～6NT處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）?

chi位點：GCTGGTGG

目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點

E.coli

含1000個、Euk.現(xiàn)在是26頁\一共有129頁\編輯于星期二e、RecBCD切割產(chǎn)生3’單鏈末端現(xiàn)在是27頁\一共有129頁\編輯于星期二

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有單、雙鏈DNA

結(jié)合活性b、RecA有NTPase活性（底物差異活性）與單鏈DNA結(jié)合時活性最大---依賴于DNAc、RecA有啟動一個分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子的能力，即聯(lián)會同源DNA

（但其靶DNA必須有缺口－－結(jié)合DNA）現(xiàn)在是28頁\一共有129頁\編輯于星期二現(xiàn)在是29頁\一共有129頁\編輯于星期二RecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型現(xiàn)在是30頁\一共有129頁\編輯于星期二RecA引起的鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)的生成

現(xiàn)在是31頁\一共有129頁\編輯于星期二

（2）RecA蛋白催化雙鏈和單鏈DNA

的反應(yīng)階段a、聯(lián)會前階段（緩慢）

RecA與單鏈結(jié)合b、單鏈與雙螺旋的互補鏈迅速配對，形成雙鏈連接分子

Holliday（5‘侵入）c、從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長的異源雙鏈DNA

反應(yīng)結(jié)束時，RecA結(jié)合到雙鏈上?其中—單鏈同化有固定的方向入侵單鏈進入的方向是5’－3‘，雙鏈DNA的互補鏈是3’－5‘現(xiàn)在是32頁\一共有129頁\編輯于星期二現(xiàn)在是33頁\一共有129頁\編輯于星期二?RecBCD和

RecA的共同作用RecBCD產(chǎn)生游離單鏈---RECA因子接到重組反應(yīng)現(xiàn)在是34頁\一共有129頁\編輯于星期二

3、原核同源重組的其它蛋白

需要E.coli中三個基因ruvA,ruvB和ruvC的產(chǎn)物a、RuvA識別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點b、RuvB為分枝遷移提供動力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸內(nèi)切酶---專一性識別Holliday結(jié)構(gòu)的連接點體外切段連接點以拆分重組體現(xiàn)在是35頁\一共有129頁\編輯于星期二?E.coli重組的各階段（損傷修復(fù)）損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol通過DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday連接點真核生物同源重組機制自學(xué)現(xiàn)在是36頁\一共有129頁\編輯于星期二7.2、位點專一性重組（

site-specificrecombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間的重組（包括一些基因表達調(diào)節(jié)、發(fā)育過程中DNA重排）噬菌體基因組整合到細菌染色體基因組中屬此種重組2、特征：?在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接

----產(chǎn)生精確的DNA重排?都具有整合作用的兩個基本特征a、典型的保守性重組---交換是相互的和保存原先的DNAb、發(fā)生在噬菌體和細菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上現(xiàn)在是37頁\一共有129頁\編輯于星期二二、λphage的整合與切除（溶原和裂解狀態(tài)）1、實現(xiàn)機制：均是通過---細菌DNA和λDNA上特定位點之間的重組2、特定位點-----附著位點（attachmentsiteatt）?E.coliattB

含BOB’三序列23bp?λphage

attP

含POP’三序列

240bp?核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位點特異性重組發(fā)生的地方?B,B’,P,P’---臂現(xiàn)在是38頁\一共有129頁\編輯于星期二3、整合過程?整合后的附著位點為

attL（BOP’）

attR（POB’）?整合位點---attB、attP

切除位點---attL、attR?整合過程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ編碼）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用現(xiàn)在是39頁\一共有129頁\編輯于星期二溶源性細菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體現(xiàn)在是40頁\一共有129頁\編輯于星期二4、整合分子機制?核心序列O全長15bp，富含A-T?發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點相距

7bp?整合酶的結(jié)合位點：attP240bp、attB23bp(兩者的作用不同)?attP位點的負超螺旋為重組所必須---加強了Int和IHF的親和力

-----高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu)?Int結(jié)合

----核心序列的反向位點（切割位置）

----結(jié)合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）現(xiàn)在是41頁\一共有129頁\編輯于星期二intIHFXis現(xiàn)在是42頁\一共有129頁\編輯于星期二?整合體及其作用整合體（intasome）---Int和IHF結(jié)合到attP時的復(fù)合物?整合體捕獲attB

說明-----

a、attB和attP的最初識別靠Int

識別兩序列的能力

b、兩序列的同源性在鏈交換時為重要因素現(xiàn)在是43頁\一共有129頁\編輯于星期二?Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結(jié)構(gòu)拆分?重組時attP和attB部位交叉斷裂，互補單鏈末端進行交叉雜交現(xiàn)在是44頁\一共有129頁\編輯于星期二例（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變現(xiàn)在是45頁\一共有129頁\編輯于星期二hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因?，F(xiàn)在是46頁\一共有129頁\編輯于星期二H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變P197現(xiàn)在是47頁\一共有129頁\編輯于星期二7.3、轉(zhuǎn)座成分概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposonortransposableelement):

基因組上不必借助于同源序列就可以移動的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個位點移到另一個位點（供體和受體）轉(zhuǎn)座（transposition）：轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展?1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉層花斑突變

玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機理

跳躍基因（jumpinggene）?1947冷泉港實驗室（美）BarbaraMcClintock現(xiàn)在是48頁\一共有129頁\編輯于星期二a)不依賴供體序列與靶位點間序列的同源性b)轉(zhuǎn)座不是簡單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots(熱點)Regionalpreference(在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機插入)d)某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會形成正向重復(fù)f)轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點c)轉(zhuǎn)座插入的靶位點并非完全隨機（插入專一型）現(xiàn)在是49頁\一共有129頁\編輯于星期二二、Prok.轉(zhuǎn)座子種類?兩種類型：簡單轉(zhuǎn)座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）?共同特征：a）兩端有20～40bp的IR(反向重復(fù)序列)b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因1、插入序列（最簡單的轉(zhuǎn)座子稱作插入序列）?最簡單，是細菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分?命名：IS＋編號（鑒定類型）長度700～2000bp現(xiàn)在是50頁\一共有129頁\編輯于星期二?特點：a）兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識別位點（突變）

b）插入靶位點后會出現(xiàn)靶位點的正向重復(fù)（3～9bp）現(xiàn)在是51頁\一共有129頁\編輯于星期二?IS可以正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)?；蚰承┦删w），常對插入位點后面的基因表達功能產(chǎn)生極性效應(yīng)現(xiàn)在是52頁\一共有129頁\編輯于星期二a)Tn/TnAfamily

l具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp轉(zhuǎn)座酶

regulatorβ-內(nèi)酰胺酶

2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子?兩種類型現(xiàn)在是53頁\一共有129頁\編輯于星期二b）兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子

e.g.

IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子ISISISISLISR臂中心區(qū)臂transposition現(xiàn)在是54頁\一共有129頁\編輯于星期二?當兩個IS組件相同時，其中任一個都可行使轉(zhuǎn)座功能?不同時，主要依靠一個?兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）現(xiàn)在是55頁\一共有129頁\編輯于星期二3轉(zhuǎn)座噬菌體Muphage

（巨型轉(zhuǎn)座子）

C

repressorforA,BB33kd與轉(zhuǎn)座有關(guān)A70kd轉(zhuǎn)座酶U,S

毒性蛋白attL,attR

與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需GinG區(qū)倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位區(qū)38kbPgin?以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解）現(xiàn)在是56頁\一共有129頁\編輯于星期二?Mu的插入途徑a）侵入的Mu在溶源化過程中任意插入寄主DNA

（兩側(cè)各5bp的靶位點序列重復(fù)）b）進入裂解生長后，復(fù)制產(chǎn)生后代MuDNA幾乎全部插入寄主

DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和Mu的共合體），噬菌體成熟時，切段共合體包裝現(xiàn)在是57頁\一共有129頁\編輯于星期二三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機制及模式?三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?實質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移動到受體位點，最終轉(zhuǎn)座過程擴增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點）?需兩種酶：轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝）?模式：現(xiàn)在是58頁\一共有129頁\編輯于星期二?兩大步a)共合體形成切口－連接－復(fù)制現(xiàn)在是59頁\一共有129頁\編輯于星期二b)拆分

靶位點的DR形成現(xiàn)在是60頁\一共有129頁\編輯于星期二2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式?供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂?供體位點如不能被修復(fù)則有致死效應(yīng)現(xiàn)在是61頁\一共有129頁\編輯于星期二五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)－－P157轉(zhuǎn)座可以導(dǎo)致基因變異插入操縱子位置可以影響操縱子下游基因表達應(yīng)用：難以篩選的基因轉(zhuǎn)移基因定位標記篩選插入突變構(gòu)建特殊菌株克隆難以進行表型鑒定的基因現(xiàn)在是62頁\一共有129頁\編輯于星期二7.3.6真核生物的轉(zhuǎn)座成分P152自學(xué)現(xiàn)在是63頁\一共有129頁\編輯于星期二

真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機制目前分為兩類：a)

轉(zhuǎn)座機制與細菌的轉(zhuǎn)座子類似需要轉(zhuǎn)座酶、兩端的IR,轉(zhuǎn)座靶點序列隨機，遺傳信息：DNA→DNA轉(zhuǎn)座酶、轉(zhuǎn)座因子兩端的IR序列，?玉米的Ac-Ds元件、果蠅的P元件和FB元件等b)

轉(zhuǎn)作機制類似逆轉(zhuǎn)錄病毒真核生物特有的轉(zhuǎn)座機制（逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座）遺傳信息：DNA→RNA→DNA逆轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)錄成RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成DNA,插入基因組，類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的作用?如：逆轉(zhuǎn)錄病毒、果蠅的copia元件、酵母的Ty元件逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，P208逆轉(zhuǎn)錄酶生物學(xué)意義：影響其他基因表達，介導(dǎo)基因重排，促進基因的流動現(xiàn)在是64頁\一共有129頁\編輯于星期二第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique現(xiàn)在是65頁\一共有129頁\編輯于星期二重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉現(xiàn)在是66頁\一共有129頁\編輯于星期二一、相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體二、基本原理及操作步驟本節(jié)主要內(nèi)容現(xiàn)在是67頁\一共有129頁\編輯于星期二一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆現(xiàn)在是68頁\一共有129頁\編輯于星期二DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)?，F(xiàn)在是69頁\一共有129頁\編輯于星期二生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等。目的①分離獲得某一目的基因或DNA②獲得目的基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作，又稱重組DNA技術(shù)?，F(xiàn)在是70頁\一共有129頁\編輯于星期二（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶現(xiàn)在是71頁\一共有129頁\編輯于星期二重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基現(xiàn)在是72頁\一共有129頁\編輯于星期二限制性核酸內(nèi)切酶

(restrictionendonuclease)識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ現(xiàn)在是73頁\一共有129頁\編輯于星期二作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類（基因工程技術(shù)中常用的是Ⅱ類）現(xiàn)在是74頁\一共有129頁\編輯于星期二第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶現(xiàn)在是75頁\一共有129頁\編輯于星期二Ⅱ類酶識別序列特點：

——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG現(xiàn)在是76頁\一共有129頁\編輯于星期二BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口現(xiàn)在是77頁\一共有129頁\編輯于星期二有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA現(xiàn)在是78頁\一共有129頁\編輯于星期二（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)現(xiàn)在是79頁\一共有129頁\編輯于星期二（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA現(xiàn)在是80頁\一共有129頁\編輯于星期二克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。現(xiàn)在是81頁\一共有129頁\編輯于星期二載體的選擇標準能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA?，F(xiàn)在是82頁\一共有129頁\編輯于星期二1.質(zhì)粒

(plasmid)特點:

能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子?，F(xiàn)在是83頁\一共有129頁\編輯于星期二現(xiàn)在是84頁\一共有129頁\編輯于星期二λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列現(xiàn)在是85頁\一共有129頁\編輯于星期二

MultipleCloningSites現(xiàn)在是86頁\一共有129頁\編輯于星期二3.柯斯質(zhì)粒(cosmid)pJB8的物理圖譜現(xiàn)在是87頁\一共有129頁\編輯于星期二酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)動物病毒DNA改造的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體桿狀病毒載體其他現(xiàn)在是88頁\一共有129頁\編輯于星期二二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取重組DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

現(xiàn)在是89頁\一共有129頁\編輯于星期二

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程現(xiàn)在是90頁\一共有129頁\編輯于星期二（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

現(xiàn)在是91頁\一共有129頁\編輯于星期二1.化學(xué)合成法由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列現(xiàn)在是92頁\一共有129頁\編輯于星期二組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.基因組DNA文庫現(xiàn)在是93頁\一共有129頁\編輯于星期二限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫現(xiàn)在是94頁\一共有129頁\編輯于星期二mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制3.

cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT現(xiàn)在是95頁\一共有129頁\編輯于星期二

是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細胞的分子克隆。4.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）現(xiàn)在是96頁\一共有129頁\編輯于星期二模板DNA引物4種dNTPTaqDNA聚合酶含Mg2+的緩沖液。PCR的反應(yīng)體系

現(xiàn)在是97頁\一共有129頁\編輯于星期二（1）變性，加熱至95℃，使模板DNA解開成單鏈；（2）退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合；（3）延伸，溫度升至72℃，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，在引物的3’-OH上，合成與模板互補的DNA新鏈。PCR的基本反應(yīng)步驟及原理

現(xiàn)在是98頁\一共有129頁\編輯于星期二

PCR反應(yīng)條件

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C現(xiàn)在是99頁\一共有129頁\編輯于星期二

PCR反應(yīng)的基本原理現(xiàn)在是100頁\一共有129頁\編輯于星期二（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建現(xiàn)在是101頁\一共有129頁\編輯于星期二BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接現(xiàn)在是102頁\一共有129頁\編輯于星期二不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似?，F(xiàn)在是103頁\一共有129頁\編輯于星期二2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端現(xiàn)在是104頁\一共有129頁\編輯于星期二目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連現(xiàn)在是105頁\一共有129頁\編輯于星期二3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接?，F(xiàn)在是106頁\一共有129頁\編輯于星期二5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′

3′5′

5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′

3′

3′5′

5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體現(xiàn)在是107頁\一共有129頁\編輯于星期二4.人工接頭(linker)連接由平端加上帶有新的酶切位點的接頭，再用限制性酶切產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接?，F(xiàn)在是108頁\一共有129頁\編輯于星期二EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ現(xiàn)在是109頁\一共有129頁\編輯于星期二受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌現(xiàn)在是110頁\一共有129頁\編輯于星期二（五）重組體的篩選

1.直接選擇法

(1)抗藥性標記選擇

(2)標志補救(markerrescue)

(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等現(xiàn)在是111頁\一共有129頁\編輯于星期二(插入