新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用專家講座

姜啟曉Nov14,新技術(shù)在醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中應(yīng)用新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第1頁內(nèi)容提要一試驗(yàn)方法介紹檢測蛋白表示水平方法：Westernblot,2D-gel,免疫共沉淀，Shotgun，免疫組化，流式細(xì)胞測定，激光掃描共聚焦顯微，綠熒光蛋白標(biāo)識法，螢光素酶標(biāo)識法，ELISA.檢測DNA/RNA表示水平方法：Southernblot,Northernblot,原位雜交,PCR.基因操作方法:基因敲除，基因緘默.新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第2頁內(nèi)容提要二實(shí)用技術(shù)介紹細(xì)胞活性檢測：MTT,MTS，CCK-8,Calcein-AM.細(xì)胞凋亡檢測：Westernblot,流式，TUNEL,Hoechst33258，DNAladder.活性氧自由基（ROS）檢測：DCF,SOD,GSH,ESR.新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第3頁Westernblot原理：Westernblot利用了蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。在一定pH緩沖液中，特定蛋白質(zhì)含有固定電荷數(shù)。在電場作用下，蛋白質(zhì)將按電荷數(shù)及蛋白質(zhì)分子量大小在凝膠中分布。SDS法Westernblot深入簡化，SDS應(yīng)用使得全部蛋白都帶均勻負(fù)電荷，此時蛋白電泳距離只與蛋白分子量大小相關(guān)。

新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第4頁Westernblot原理：凝膠是由聚丙烯酰胺組成，聚丙烯酰胺濃度決定了膠中孔徑大小，孔徑越大，蛋白運(yùn)動越輕易，越快，對大分子量蛋白分離效果好。反之亦然。測定大分子量蛋白（>１００ＫＤ）時宜用低濃度膠，測定小分子量蛋白（<３０ＫＤ）時宜用高濃度膠。另有梯度膠（比如４－１５％），能夠確保在一定范圍內(nèi)蛋白都相對均勻分離。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第5頁轉(zhuǎn)膜方法主要分為濕轉(zhuǎn)(Wettransfer)和半干轉(zhuǎn)（Semi-drytransfer）。濕轉(zhuǎn)速度較慢，操作難度較大，易出現(xiàn)氣泡，但轉(zhuǎn)膜效率高，尤其對大分子量蛋白效果好。半干轉(zhuǎn)特點(diǎn)與濕轉(zhuǎn)恰好相反，對大分子量蛋白輕易轉(zhuǎn)不上。依據(jù)實(shí)際情況選擇。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第6頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第7頁Westernblot電泳完成后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到固相載體（NC膜或者PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離多肽類型及其生物學(xué)活性不變。膜上非特異性結(jié)合位點(diǎn)需使用脫脂牛奶等封閉，以固相載體上蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)抗體起免疫反應(yīng)，再與酶,同位素或者熒光標(biāo)識第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色,放射自顯影或熒光成像以檢測電泳分離特異性目標(biāo)基因表示蛋白成份。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第8頁示例試驗(yàn)步驟：①蛋白質(zhì)抽提

②蛋白濃度測定：按試劑盒說明書，用BCA法測定蛋白濃度。③變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)：玻璃板夾槽中依次加入分離膠和濃縮膠，待其凝固；依據(jù)濃度取適量待測蛋白與5x上樣緩沖液混勻后,95度變性10分鐘,加入上樣孔中，浸于電泳緩沖液，以75V（濃縮膠）及120V（分離膠）恒壓電泳。④轉(zhuǎn)膜：裁切與凝膠一樣大小NC膜和濾紙，NC膜置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30min以上。按次序依次放置濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，半干法以40mA恒流轉(zhuǎn)膜2h。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第9頁⑤抗原抗體反應(yīng):蛋白質(zhì)以脫脂牛奶封閉1h后，與一抗4℃孵育過夜，與二抗室溫孵育1h，TBST洗滌4次，每次5min。⑥顯色:加入DAB顯色5min，蒸餾水洗終止顯色。凝膠分析軟件Quantityone測灰度值。

顯色系統(tǒng)各種多樣。傳統(tǒng)二抗通常是與辣根過氧化酶結(jié)合抗體，遇DAB顯色或者與專用試劑盒試劑反應(yīng)使膠片曝光。新型二抗與熒光物質(zhì)結(jié)合，在專用熒光成像儀下讀取熒光印跡，能夠方便地進(jìn)行多通道westernblot(multiplexwesternblotting),免去切膜或者抗體去除步驟.新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第10頁2D-Gel新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第11頁免疫共沉淀是一個著重檢測蛋白-蛋白或蛋白-核酸間聯(lián)絡(luò)方法?；驹硎抢每乖贵w結(jié)合,以及與抗體相連小珠（Beads）,以物理方式將目標(biāo)蛋白連同與其相結(jié)合物質(zhì)分離出來單獨(dú)分析。分離后，解離蛋白，以Westernblot方式檢測潛在目標(biāo)水平，即可得知目標(biāo)間在細(xì)胞中是否有緊密聯(lián)絡(luò)。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第12頁免疫共沉淀新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第13頁Chromatinimmunoprecipitation（CHIP）染色質(zhì)免疫沉淀，與蛋白共沉淀相同，不一樣之處是利用甲醛等產(chǎn)生DNA與其上蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而用帶小珠抗體將蛋白質(zhì)與DNA一起“拉下”，用PCR檢測拉下DNA.新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第14頁“獵槍”法（Shotgunproteomic）新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第15頁免疫組化

Immunohistochemistry原理類似Westernblot，但直接在組織切片（或在滿足一定條件情況下，整個組織）上進(jìn)行，保留了原始組織結(jié)構(gòu)，能提供更多信息。缺點(diǎn)：費(fèi)時，目標(biāo)蛋白表示不高時不易檢測到，量化統(tǒng)計不易。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第16頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第17頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第18頁免疫組化樣本制備通常來講，免疫組化用樣本為組織切片（幾微米厚）.足夠小且能被完全通透化（Permeabilize)組織能夠直接做在位免疫組化，但應(yīng)用不如原位雜交來得廣泛。冷凍切片信號很好，但受時間，地點(diǎn)，存放條件等限制。石蠟切片含有儲存，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但需要抗原修復(fù)方可進(jìn)行免疫組化染色，且效果普通差于冷凍切片。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第19頁免疫組化抗體使用免疫組化中使用一抗通常與Westernblot中用相同。二抗被設(shè)計成與一抗宿主結(jié)合抗體，普通結(jié)合有探測用分子，免疫組化中慣用是生物素（biotin）。一抗宿主普通不能與試驗(yàn)所用組織同種，但必要時也有專用試劑能夠允許這種應(yīng)用例子：MOM（MouseonMouse)Kit。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第20頁不一樣探測方法直接探測法：直接標(biāo)識一抗，不需使用二抗來探測目標(biāo)蛋白表示水平，最簡單但敏感度最差，基本已不用。間接探測法：一抗沒有標(biāo)識，然后用抗一抗二抗來間接探測目標(biāo)蛋白表示水平。有信號放大作用，敏感度好，節(jié)約試劑。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第21頁間接探測法介紹：PAP法PAP:peroxidaseanti-peroxidasemethod

PAP法使用未標(biāo)識一抗和二抗，之后加入第三層探針：peroxidase及其抗體，且抗體抗原性與一抗相同，都與二抗相結(jié)合。如此以二抗為中心形成“三明治”結(jié)構(gòu)。

新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第22頁Avidin-BiotinComplex(ABC)法免疫組化最慣用方法之一。也是形成“三明治”樣結(jié)構(gòu)，使用未標(biāo)識一抗，生物素（biotin）標(biāo)識二抗，生物素標(biāo)識peroxidase以及生物素結(jié)合蛋白（Avidin）。需要封閉內(nèi)源性

peroxidase。必要時，封閉內(nèi)源性

biotin。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第23頁LabeledStreptavidinBiotin(LSAB)法

與ABC法相同，但使用Strptavidin替換普通生物素結(jié)合蛋白，其與組織非特異性結(jié)合較少，所以能夠降低背景。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第24頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第25頁免疫組化中注意關(guān)鍵點(diǎn)樣本準(zhǔn)備封閉（非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，內(nèi)源性peroxidase，內(nèi)源性biotin）抗體濃度培養(yǎng)溫度顯色時間新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第26頁流式細(xì)胞儀1試驗(yàn)原理:

流式細(xì)胞儀(FlowCytometer)是采取流式細(xì)胞技術(shù)對細(xì)胞或顆粒懸液進(jìn)行快速分析自動化分析儀器。流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry)是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來一項新技術(shù)。它經(jīng)過對流動液體中排成單列細(xì)胞或顆粒進(jìn)行逐一分析、測定細(xì)胞或顆粒光散射和熒光情況，以取得其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理或化學(xué)特征。要求細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。對于貼壁細(xì)胞，需要先將其游離出來，有一定損傷。

新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第27頁流式細(xì)胞儀應(yīng)用舉例細(xì)胞凋亡、死亡檢測-AnnexinV/PI雙染色法1原理細(xì)胞凋亡早期生化特征之一是氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶活性降低使磷脂酰絲氨酸(Phosphatdylserine)“翻到”細(xì)胞膜外層。熒光標(biāo)識AnnexinV-FITC(AV)和碘化丙啶(propidumiodide,PI)雙染可區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死,對AV和PI均不染色是正常細(xì)胞,對AV染色對PI不染色為早期凋亡細(xì)胞,對AV和PI均染色為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。2結(jié)果判斷凋亡細(xì)胞對全部用于細(xì)胞活性判定染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷細(xì)胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。所以，在細(xì)胞凋亡早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴?xì)胞與此相同。在雙變量流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第28頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第29頁

[Ca2+]i檢測－Fluo-3-AM熒光染色原理用熒光探針Fluo-3-AM進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶水解為Fluo-3,后者是鈣離子螯合劑,與鈣離子形成復(fù)合物經(jīng)紫外激發(fā)可產(chǎn)生熒光,流式細(xì)胞儀經(jīng)過檢測其熒光強(qiáng)度而間接反應(yīng)胞內(nèi)游離鈣水平。人參皂苷(saponin)降低缺氧心肌細(xì)胞中鈣超載。Lietal.Thesaponinofredginsengprotectsthecardiacmyocytesagainstischemicinjuryinvitroandinvivo,Phytomedicine,19(6)477-483新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第30頁線粒體膜電位（ΔψМ）測定－rhodanmine123熒光染色原理氧化刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可致線粒體兩種功效改變:一是線粒體膜電位降低和線粒體通透性孔開放,二是線粒體產(chǎn)生活性氧。線粒體對rhodanmine123攝取依賴其膜電位,分析rhodanmine123熒光強(qiáng)度可反應(yīng)線粒體膜電位。

Black:control,Purple:UVBmodel,Yellow:UVB+0.25%PCF,Red:UVB+0.5%PCF,Blue:UVB+1%PCF,Green:UVB+0.1%VitC.新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第31頁激光掃描共聚焦顯微(ConfocalLaserScanningMicroscopy，CLSM）1基本原理激光共聚焦顯微鏡是近年來發(fā)展起來一個結(jié)合激光掃描、計算機(jī)自動分析與顯微鏡技術(shù)新技術(shù)，新儀器。它采取計算機(jī)自動定量分析被激光掃描物體所激發(fā)出熒光數(shù)量改變，含有圖像清楚、特異性高、敏感性強(qiáng)、可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)。2優(yōu)點(diǎn)①激光共聚焦顯微鏡做間接免疫熒光組化染色并做定量分析，利用激光聚焦／熒光標(biāo)識和系統(tǒng)軟件分析對組織進(jìn)行深層與斷層掃描，不破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可準(zhǔn)確深層次定位和準(zhǔn)確定量，是轉(zhuǎn)化了準(zhǔn)確定量分析。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第32頁②激光共聚焦顯微鏡普通都有2個以上不一樣波長激光管，所以只要將標(biāo)本標(biāo)識上不一樣波長熒光，就能夠在同一張切片上同時分析2種或更多不一樣指標(biāo)改變，并比較它們之間比值改變，方便而準(zhǔn)確。③激光共聚焦顯微鏡能夠依據(jù)科研需要，提供純熒光、白光、以及熒光與白光合成圖像等各種圖像。④以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標(biāo)本，如用石蠟切片做免疫熒光染色，在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過強(qiáng)而影響觀察結(jié)果。但如用激光共聚焦顯微鏡掃描石蠟切片熒光染色，可取得清楚圖像。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第33頁3應(yīng)用㈠定性定量定位熒光分析:CLSM可對單、雙或三色標(biāo)識細(xì)胞及組織標(biāo)本熒光進(jìn)行定性定量定位分析，還可測定膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。㈡Ca2和pH等細(xì)胞內(nèi)離子實(shí)時定量測定:利用Fluo-3、Fura2等熒光探針，CLSM能夠測定Ca2在活細(xì)胞內(nèi)濃度改變。CLSM可測定單個或一群細(xì)胞內(nèi)ca2濃度，并提供細(xì)胞內(nèi)Ca2分布二維及至三維圖像。另外，假如對細(xì)胞施加外部刺激，CLSM就能觀察到細(xì)胞內(nèi)各點(diǎn)Ca2

濃度在外部刺激下隨時間而產(chǎn)生改變。這對于研究Ca2

等離子細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)有意義。利用SNAFL類探針可對單個或一群細(xì)胞內(nèi)pH及細(xì)胞內(nèi)pH改變進(jìn)行測定。使用雙熒光探針Fluo一3和CNARF可進(jìn)行Ca2

和pH同時測定。㈢細(xì)胞物理化學(xué)動態(tài)監(jiān)測：CLSM可對細(xì)胞形狀、周長、面積、平均熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動測定，能對細(xì)胞溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時及定位測定。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第34頁㈣藥理研究中應(yīng)用：CLSM可直接觀察藥品在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞水平分布，并可了解藥品對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)特殊親和力及其藥品作用，從而推斷細(xì)胞內(nèi)藥品定位及細(xì)胞耐藥相關(guān)機(jī)制，還可了解其在細(xì)胞內(nèi)代謝過程。例CLSM可直接觀察扇貝多肽（PCF）在細(xì)胞定位。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)識PCF，顯微鏡下確定PCF作用位點(diǎn)在細(xì)胞膜上。圖3PCF保護(hù)HaCaT細(xì)胞最初作用靶點(diǎn)新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第35頁㈤激光顯微細(xì)胞外科技術(shù)：CLSM可將激光作為“光子刀”使用，完成諸如細(xì)胞膜瞬間穿孔，線粒體、溶酶體等細(xì)胞器燒灼，染色體準(zhǔn)確切割和神經(jīng)元突起切除等一系列細(xì)胞外科術(shù)。㈥在亞細(xì)胞定位研究中應(yīng)用：經(jīng)熒光探針標(biāo)識細(xì)胞器，CLSM可探測光敏劑和探針熒光圖像，實(shí)現(xiàn)對光敏劑在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞定位，并進(jìn)行定性和定量分析。㈦在藥品抗腫瘤活性研究中應(yīng)用：利用CLSM觀察細(xì)胞形態(tài)，統(tǒng)計細(xì)胞熒光程度，以細(xì)胞熒光程度反應(yīng)DNA含量，從而判斷藥品抗癌活性。㈧在釋藥過程研究中應(yīng)用：因?yàn)镃LSM實(shí)時觀察能力，可對控釋藥品釋藥過程中藥品損耗改變進(jìn)行觀察。4缺點(diǎn)：①不能觀察到大部分膜結(jié)構(gòu)特征，尤其是ultrafiltration膜結(jié)構(gòu)。②成像質(zhì)量與掃描速度一直是一對矛盾。③掃描過程耗時較長，且只能掃描不動微生物，許多活動大型微生物因運(yùn)動比較猛烈而對成像造成一定影響。④一些熒光染料可能會對一些活體細(xì)胞活性造成一定負(fù)面影響，所以宜選擇適當(dāng)熒光染料，同時適當(dāng)?shù)卣{(diào)整激光光強(qiáng)，宜用最弱光對標(biāo)本進(jìn)行照射掃描。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第36頁ReporterAssay為檢測特定基因能否在目標(biāo)生物體內(nèi)表示及表示水平，Reporterassay常被使用。PromoterTargetGeneReporterGenePromoterTargetGeneProductsReporterProductsEasyDetection新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第37頁綠熒光蛋白標(biāo)識OsamuShimomura,MartinChalfie及RogerTsien

于年因綠熒光蛋白發(fā)覺，獲諾貝爾化學(xué)獎。

新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第38頁熒光素酶標(biāo)識新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第39頁直接ELISA:

直接使用酶標(biāo)識一抗探測固定抗原。最為簡單，防止二抗可能交叉反應(yīng)，但敏感性較差，需要大量昂貴標(biāo)識抗體。間接ELISA:不直接標(biāo)識一抗，而是標(biāo)識抗一抗二抗。信號能夠被有效放大，且一抗免疫活性不會受標(biāo)識影響。但二抗可能發(fā)生交叉反應(yīng)?！叭髦巍?/p>

ELISA:

先在盤中固定一層捕捉抗體（Captureantibody），以之將目標(biāo)抗原捕捉，之后再使用一層標(biāo)識探測抗體。兩種抗體必須小心選擇以防止相互之間反應(yīng)。此法不需純化抗原，同時含有極高敏感性和特異性。但反抗原有要求：最少有兩個結(jié)合位點(diǎn)。競爭性ELISA:

樣本和純化并事先固定目標(biāo)抗原對標(biāo)識抗體進(jìn)行競爭，假如樣本中存在目標(biāo)抗原，最終得到信號就會下降。此法可用于不純樣本，重復(fù)性可靠，但敏感性和特異性都較低。ELISA

（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第40頁ELISA

（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第41頁酶標(biāo)儀1原理

酶標(biāo)儀（MicroplateReader）是對用專用反應(yīng)盤進(jìn)行，建立在吸光度改變基礎(chǔ)上各種試驗(yàn)進(jìn)行讀取設(shè)備，因其主要用途之一是讀取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果而得名。但其也可讀取其它試驗(yàn)結(jié)果，如蛋白定量，各種酶活性檢測，MTT等。新式酶標(biāo)儀除讀取普通吸光度外，還能夠讀取熒光數(shù)據(jù)：試驗(yàn)者指定激發(fā)光波長及放射光波長，帶熒光讀取功效酶標(biāo)儀即可讀取該數(shù)據(jù)。同時還有酶標(biāo)儀帶加溫，振蕩，定時重復(fù)讀取等等功效，極大地方便了試驗(yàn)。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第42頁SouthernBlotting新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第43頁EdwinSouthern,SouthernBlotting創(chuàng)造者。左圖為他在Nature上關(guān)于SouthernBlotting文章中例圖。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第44頁NorthernBlotting新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第45頁Insituhybridization(原位雜交技術(shù))1原理原位雜交本質(zhì)就是在一定溫度和離子濃度下，使含有特異序列單鏈探針經(jīng)過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中特異性核酸得到定位，并經(jīng)過探針上所標(biāo)識檢測系統(tǒng)將其在核酸原有位置上顯示出來。

新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第46頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第47頁舉例：原位雜交檢測p21mRNA將用DEPC處理后無菌蓋玻片（細(xì)胞飛片）置入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞于孔內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞80％融合，處理同1.2細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞飛片用中性樹膠粘于載玻片上，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗5min×2次，系列酒精脫水。蛋白酶K消化細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脫水后于37℃用不含探針雜交液預(yù)雜交45min。加入含探針90g·L-1雜交液，置于密閉濕盒中，60℃過夜。雜交結(jié)束后，NBT顯色，中性樹膠封片。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第48頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第49頁P(yáng)CR(PolymeraseChainReaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是研究工作中最慣用到技術(shù)之一。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第50頁TaqDNA聚合酶在黃石國家公園沸泉耐熱細(xì)菌中發(fā)覺并分離，在72攝氏度下可正常反應(yīng)，高達(dá)95攝氏度情況下仍不變性，是PCR反應(yīng)得以進(jìn)行基礎(chǔ)。當(dāng)代技術(shù)已經(jīng)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出各種改良型耐高溫DNA聚合酶，使反應(yīng)效率提升，反應(yīng)條件要求降低。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第51頁P(yáng)CR條件DNA聚合酶。反應(yīng)所需模板（Template），DNA分子。反應(yīng)所需引物（Primer），兩個方向。反應(yīng)所需原料（dNTPs）。適宜緩沖液。適宜反應(yīng)溫度。Real-timePCR還需要熒光染料。當(dāng)前很多試劑廠商以“MasterMix”形式提供PCR試劑，極大地方便了試驗(yàn)。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第52頁P(yáng)CR分類以DNA為起始點(diǎn)PCR（目標(biāo)為大量復(fù)制擴(kuò)增目標(biāo)基因）。以RNA為起始點(diǎn)PCR（RT-PCR，目標(biāo)為檢測目標(biāo)基因表示強(qiáng)度），其又可分為普通RT-PCR和Real-timeRT-PCR。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第53頁RT-PCR普通步驟1.RNA抽提經(jīng)典方法是利用RNA在酒精中溶解度低使之析出。較新RNA抽提試劑盒在此基礎(chǔ)上利用了能特異性與RNA結(jié)合微型分離柱，大大提升RNA產(chǎn)率和純度。2.檢測RNA質(zhì)量和濃度比色法檢測OD260/280和OD260/230，前者在DNA應(yīng)該為1.8而RNA應(yīng)該為2左右，后者應(yīng)該在2.0-2.2左右.

Nanodrop儀器可用極小量樣本作快捷而相對準(zhǔn)確檢測。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第54頁RT-PCR普通步驟3.逆轉(zhuǎn)錄。普通應(yīng)用試劑盒進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)錄酶，mRNA逆轉(zhuǎn)錄引物及對應(yīng)原料，緩沖液等與抽提到RNA混合，在適宜溫度下，從RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。4.PCR反應(yīng)。將PCR各原料，引物及模板混合后，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。如為普通RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物電泳，EB染色后凝膠成像分析，如為Real-timePCR，反應(yīng)結(jié)束后直接取數(shù)據(jù)分析即可。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第55頁半定量RT-PCR直接完成指定周期數(shù)PCR反應(yīng)后，以電泳及EB染色法確定終產(chǎn)物量。優(yōu)點(diǎn)：不需尤其試劑和儀器，成本低廉。缺點(diǎn)：檢測敏感度較差，試驗(yàn)步驟較繁瑣，且包括有毒試劑EB使用。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第56頁Real-TimePCR借助與雙鏈DNA特異性結(jié)合發(fā)出熒光特殊染料（如SYBRGreen），在每一個PCR周期完成后都讀取一次產(chǎn)物量，能夠得到實(shí)時PCR產(chǎn)物擴(kuò)增數(shù)量并較準(zhǔn)確地定量分析。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)敏感度好，CT(Cyclethreshold)值測定防止了非線性擴(kuò)增對結(jié)果干擾。缺點(diǎn)：需要專用PCR儀器，器材及試劑價格較昂貴。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第57頁Real-TimePCR示例注意在使用SYBRGreen為基礎(chǔ)Real-timePCR時要檢測熔化曲線以確定得到是單一產(chǎn)物。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第58頁P(yáng)CR易出現(xiàn)問題產(chǎn)物錯誤：引物設(shè)計不佳/結(jié)合溫度有誤/存在污染/鎂離子濃度不妥。無產(chǎn)物：引物設(shè)計不妥或引物數(shù)量不足/存在干擾反應(yīng)物質(zhì)/污染/試驗(yàn)方法或設(shè)備問題。多重產(chǎn)物：結(jié)合溫度設(shè)置太低/鎂離子濃度不妥/引物過多或生成引物二聚體/外來DNA污染。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第59頁多重產(chǎn)物及處理實(shí)例左上為多重產(chǎn)物實(shí)例。能夠看到即使只加入一個引物，此反應(yīng)卻生成了兩種產(chǎn)物。調(diào)整試驗(yàn)條件（主要是結(jié)合溫度）后，同一反應(yīng)得到均一產(chǎn)物。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第60頁Microarray新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第61頁基因敲除經(jīng)典基因敲除法（Knockout），將目標(biāo)基因替換為一個外源性基因（慣用耐新霉素基因以方便篩選細(xì)胞），從而敲除目標(biāo)基因。相對來講，經(jīng)典基因敲除法較為簡單。但有一些不足之處，如有基因敲除就無法讓動物生存，有會被代償?shù)?。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第62頁條件敲除（ConditionalKnockout）普通是靠Cre-LoxP/FLP-Frt重組系統(tǒng)來完成，目標(biāo)基因上被加入LoxP或Frt元素，帶有LoxP小鼠與在一些組織上特異性表示Cre（或者Flp）小鼠交配，后代特定器官上該基因即被敲除。易造成錯位翻譯。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第63頁四環(huán)素控制條件基因表示/緘默：轉(zhuǎn)錄激活子（Transactivator）rTA，在無四環(huán)素存在前提下，能與一個尤其定制操縱子tet-O結(jié)合，激活下游目標(biāo)基因表示，而四環(huán)素（如多西環(huán)素）應(yīng)用將使此激活子與四環(huán)素結(jié)合，快速中止目標(biāo)基因表示。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第64頁RNA干擾1原理：

近年來研究表明，將與mRNA對應(yīng)正義RNA和反義RNA組成雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，能夠使mRNA發(fā)生特異性降解，造成其對應(yīng)基因緘默。這種轉(zhuǎn)錄后基因緘默機(jī)制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。2小干涉RNA（siRNA）：

是在RNA干涉過程中人工體外合成小片段RNA，由19-21個堿基正確關(guān)鍵部分和每條鏈上2個懸掛核苷酸組成。3應(yīng)用：

①研究信號傳導(dǎo)通路和基因功效

RNAi能夠在哺乳動物中降低特異性基因表示，制作各種表型，而且抑制基因表示時間，控制基因表示部位。

②開展基因治療新路徑

一基因家族多個基因含有一段同源性很高保守序列這一特征，設(shè)計針對這一區(qū)段序列dsRNA分子，只注射一個dsRNA即能夠產(chǎn)生多個基因表示同時降低表現(xiàn)，也可同時注射各種dsRNA而將多個序列不相關(guān)基因同時剔除。為治療多基因調(diào)控腫瘤疾病，帶來新治療策略。

新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第65頁新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第66頁Fas干擾試驗(yàn)設(shè)計空白對照組、UVB模型組、UVB＋試劑對照組

(不加siRNA,僅加入轉(zhuǎn)染試劑)、UVB＋siRNA組接種細(xì)胞至6孔板讓其在有血清無抗生素培養(yǎng)基中生長，使得轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%

轉(zhuǎn)染siRNA組每孔加入800μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物[8μLsiRNA溶于100μL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基＋8μLsiRNA轉(zhuǎn)染試劑溶于100μL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基]新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第67頁37℃、5%CO2孵育5－7h去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換含10%小牛血清正常培養(yǎng)基37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育18－24h轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行UVB照射30min干擾效率檢測

RT-PCR干擾后FasmRNA表示檢測水平

Westernblot檢測干擾后Fas蛋白表示水平新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第68頁慣用試驗(yàn)技術(shù)介紹新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第69頁細(xì)胞活性（CellViability）檢測檢測樣本中活細(xì)胞相對數(shù)量。最為慣用試驗(yàn)伎倆之一，在抑瘤，毒理，細(xì)胞保護(hù)等試驗(yàn)中都必不可少。MTTMTSCCK8Calcein-AM染色PI染色TrypanBlue染色新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第70頁MTT法MTT，化學(xué)名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑鹽?；罴?xì)胞，尤其是增殖細(xì)胞中能量代謝旺盛，其中線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶可將淡黃色MTT還原為藍(lán)色結(jié)晶formazan沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，形成結(jié)晶與增殖細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜（DMSO）可溶解formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波優(yōu)點(diǎn)測定其光吸收值，可間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)典方法，缺點(diǎn)是較麻煩，誤差相對也較大。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第71頁

MTT改進(jìn)型：MTSMTS是在MTT基礎(chǔ)上加以改進(jìn)一個四唑鹽，Promega企業(yè)將其與電子偶聯(lián)劑PES穩(wěn)定混合，形成單一溶液形式，易用而穩(wěn)定細(xì)胞活力檢測試劑。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第72頁CCK-8法CCK-8（CellCountingKit-8），是碧云天企業(yè)推出另一個MTT改進(jìn)型，基于MTT另一個衍生物WST-8，與MTS法相同，只需將單一溶液加入即可測定活細(xì)胞相對數(shù)量。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第73頁Calcein-AM染色

Calcein-AM是一個熒光染料Calcein前體，能穿透細(xì)胞膜，在活細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為Calcein，熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)量成正比?？捎糜跓晒怙@微鏡下標(biāo)識細(xì)胞。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第74頁P(yáng)I染色法PropidiumIodide(PI)為DNA嵌入劑（Intercalator），同時為一熒光染料。PI特征是無法穿過活細(xì)胞膜，所以其能被用來確定死細(xì)胞。前面流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)介紹過經(jīng)過PI染色確定細(xì)胞是否死亡方法。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第75頁TrypanBlue染色法TrypanBlue(臺盼藍(lán)）也是一個只能染色死細(xì)胞染料，與PI不一樣之處是其染色肉眼可見，可給出直觀細(xì)胞生存是否表述。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第76頁細(xì)胞凋亡檢測Westernblot流式細(xì)胞術(shù)TUNELHoechst33258染色DNAladder新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第77頁細(xì)胞凋亡信號通路新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第78頁Westernblot檢測細(xì)胞凋亡需要同時檢測兩個目標(biāo)：Caspase-3及PARP（PolyADP-RibosePolymerase）Caspase-3在正常細(xì)胞中以前體酶（Procaspase-3）形式存在，約為32KD。凋亡發(fā)生時，前體酶被剪切為含有活性Caspase-3，兩個亞基分別約為17KD和

12KD（分子量隨不一樣物種有少許波動）新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第79頁P(yáng)ARP是一個DNA修復(fù)酶，是激活caspase-3底物。正常全長PARP為116KD,被caspase-3剪切后則被分為89KD和24KD兩段。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第80頁流式細(xì)胞術(shù)法檢測凋亡在流式細(xì)胞術(shù)一節(jié)已經(jīng)講到，以AnnexinV/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀即可分辨正?；罴?xì)胞，早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡/壞死細(xì)胞。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第81頁TUNELTerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標(biāo)識。基于Terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)應(yīng)用。凋亡發(fā)生時，DNA被切斷，暴露殘端能夠被TdT識別，進(jìn)而將dNTP聯(lián)接到DNA殘端上。經(jīng)過標(biāo)識dNTP，凋亡細(xì)胞能夠被在位標(biāo)識出來。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第82頁TdT只識別凋亡時產(chǎn)生DNA斷裂，而不會識別其它原因如輻射造成DNA斷裂，故可特異性顯示凋亡細(xì)胞。慣用Biotin-Streptavidin-HRP系統(tǒng)（與免疫組化相仿）顯色。注意需要阻斷內(nèi)源性過氧化酶，biotin高表示組織還需要阻斷內(nèi)源性biotin。新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第83頁Kumar

etal.

CardiovascularDiabetology

6:34新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用第84頁Hoechst33258熒光染色1原理：細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮。Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞細(xì)胞核呈正常藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞細(xì)胞核會呈致密濃染或呈碎塊致密濃染，顏色有些發(fā)白。2步驟：

①細(xì)胞種入放潔凈蓋玻片六孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合至80~90%。

②外界刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡（紫外線照射）

③Hoechst33258染色