厭氧菌的分離和鑒定

厭氧菌分離與判定衛(wèi)生部北京醫(yī)院陳東科厭氧菌的分離和鑒定第1頁

厭氧菌檢驗(yàn)是臨床微生物檢驗(yàn)主要組成部分。在無氧（或少氧）條件下，或氧化還原電勢低條件下才能繁殖細(xì)菌稱為厭氧菌。因?yàn)閰捬蹙谌梭w腸道、口腔、泌尿生殖道正常菌群中占優(yōu)勢，所以當(dāng)人體菌群失調(diào)時(shí)，厭氧菌可能侵犯人體許多部位，發(fā)生嚴(yán)重甚至致死內(nèi)源性厭氧菌感染。厭氧菌感染常發(fā)生在深部傷口,但也可伴兼性厭氧菌和需氧菌侵犯人體任何器官和組織。所以，對厭氧菌檢驗(yàn)應(yīng)給予高度重視。厭氧菌的分離和鑒定第2頁

人體各部位厭氧菌寄生量及其與需氧菌之比__________________________________________________________厭氧菌數(shù)量眼結(jié)膜鼻涕唾液牙表面牙周袋與牙垢

__________________________________________________________（cfu\g）103~4101~4108~9109~101011~12

厭氧菌與

需氧菌之比10:110:18~10:11:11000:1

__________________________________________________________厭氧菌數(shù)量胃液結(jié)腸小腸陰道外尿道皮膚

__________________________________________________________（cfu\g）102~51011~12104~6108~9103~5103~4

厭氧菌與

需氧菌之比1:11000:11:110:110:110:1__________________________________________________________厭氧菌的分離和鑒定第3頁1.正確地選擇標(biāo)本以下細(xì)菌學(xué)指征有利于選擇標(biāo)本做厭氧培養(yǎng)：

（1）深部傷口或軟組織膿腫膿，尤其是伴有惡臭或含有硫磺顆粒時(shí)。

（2）可疑為氣性壞疽或少見嚴(yán)重產(chǎn)氣或壞死性感染所取得壞死組織或病灶去除材料。

（3）粘膜部位感染灶取得材料。

（4）從腦、肺、肝或其它器官膿腫或從腹腔內(nèi)、肛周、隔下或其它部位膿腫取得材料。厭氧菌的分離和鑒定第4頁

（5）無菌區(qū)感染灶吸出液(包含血液、腦脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。

（6）人或動(dòng)物咬傷感染灶取得材料。

（7）變黑或置于紫外線發(fā)紅色熒光滲出物。

（8）革蘭染色，鏡下見到含有厭氧菌獨(dú)特形態(tài)材料。

（9）可疑引發(fā)肉毒桿菌食物中毒食物。厭氧菌的分離和鑒定第5頁2.正確地搜集標(biāo)本厭氧菌是人體許多部位（如皮膚、口咽部、腸道和泌尿生殖道）正常菌群中一部分，所以以下材料無需做厭氧培養(yǎng)：

（1）咽、鼻、尿道或直腸拭子。

（2）咳出痰，經(jīng)過支氣管鏡取分泌物，排出或?qū)С瞿?、糞及胃內(nèi)容物。厭氧菌的分離和鑒定第6頁

為排除或盡可能降低正常菌群中厭氧菌污染，用注射器抽取標(biāo)本比用拭子更加好，尤其適合用于以下臨床情況：

（1）從未開放膿腫抽取膿液。

（2）經(jīng)過胸腔穿刺抽出胸腔液。

（3）從恥骨聯(lián)合上方做膀胱穿刺吸出或從腎造口管搜集尿。

（4）氣管切開吸收肺分泌物。厭氧菌的分離和鑒定第7頁

（5）穿刺抽出腹腔液。

（6）經(jīng)過腰椎穿刺抽出腦脊液。

（7）竇道標(biāo)本可插入小導(dǎo)管用注射器吸出，注射器和針頭內(nèi)氣體應(yīng)全部排出，將其內(nèi)容物直接注入一個(gè)已排出氣無菌試管內(nèi)。也可自竇道損傷部位取材做活組織檢驗(yàn)。假如必須使用拭子，應(yīng)盡快接種于適宜培養(yǎng)基中。厭氧菌的分離和鑒定第8頁

3.正確地運(yùn)輸標(biāo)本臨床標(biāo)本一旦離開人體部位，在進(jìn)入?yún)捬醐h(huán)境前，必須預(yù)防大氣中氧毒性作用。應(yīng)及時(shí)將取材拭子、塑料導(dǎo)管內(nèi)少許液體、吸入注射器標(biāo)本裝入?yún)捬跎锎蚬?，在運(yùn)輸過程中要保持厭氧狀態(tài)。培養(yǎng)基內(nèi)不應(yīng)含有肝素，因它會(huì)抑制細(xì)菌生長。厭氧菌的分離和鑒定第9頁

4.使用新配制培養(yǎng)基初代接種厭氧菌最好使用新配制培養(yǎng)基。

平板培養(yǎng)基無需在厭氧條件下貯存，用前可進(jìn)行預(yù)還原，但厭氧條件下貯存可延長培養(yǎng)基使用期。厭氧菌的分離和鑒定第10頁

5.提供可靠厭氧環(huán)境使用厭氧罐法、厭氧袋法或厭氧箱法。在厭氧培養(yǎng)中必須使用氧化還原指示劑，普通采取亞甲基美蘭或刃天青，每次要新鮮配制。假如能在孵育整個(gè)過程中維持厭氧條件，指示劑溶液將無色，不然指示劑則變色。厭氧菌的分離和鑒定第11頁厭氧菌的分離和鑒定第12頁厭氧菌的分離和鑒定第13頁厭氧菌的分離和鑒定第14頁厭氧菌的分離和鑒定第15頁6.標(biāo)本接種與孵育

（1）拭子和液體標(biāo)本直接接種固體和液體培養(yǎng)基（需氧和厭氧培養(yǎng)各一份），在厭氧平板上貼一片滅滴靈紙片（5μg/片），置35℃培養(yǎng)。同時(shí)做直接涂片革蘭染色鏡檢。用鉑-銥合金環(huán)（不用鎳-鉻合金環(huán)，因?yàn)樗裳趸臃N物）三區(qū)劃線接種平板，以確保長出單個(gè)菌落。（2）若被檢標(biāo)本是組織塊，則立刻將其移入無菌組織研磨器內(nèi)，用硫乙醇酸鹽混合研碎，最好在厭氧箱內(nèi)或無氧條件下操作。組織勻漿接種同液體標(biāo)本。（3）可疑含有芽胞梭菌標(biāo)本，還要用乙醇或加熱處理后再行接種。厭氧菌的分離和鑒定第16頁7.直接涂片檢驗(yàn)當(dāng)有足夠標(biāo)本或收到兩個(gè)拭子時(shí)，最好在接種前做涂片革蘭染色鏡檢，檢驗(yàn)結(jié)果可提醒需要接種哪些培養(yǎng)基（非常規(guī)使用）。涂片檢驗(yàn)可看出有沒有細(xì)菌，微生物類型和大約數(shù)量以及芽胞、形狀和位置（芽胞梭菌）、著色情況及菌體特征。對血性液體或濃稠分泌物用丫啶橙染色比革蘭染色較易觀察。這些初步結(jié)果應(yīng)該及時(shí)向主管醫(yī)生匯報(bào)，以幫助他們正確選取抗菌藥品。涂片檢驗(yàn)可查對培養(yǎng)結(jié)果是試驗(yàn)室質(zhì)量控制一個(gè)主要指標(biāo)。厭氧菌的分離和鑒定第17頁8.厭氧菌判定（1）滅滴靈紙片周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)說明有厭氧菌生長（絕大多數(shù)專性厭氧菌對滅滴靈敏感，兼性厭氧菌耐藥）。（2）耐氧試驗(yàn)：接種BRBA平板（需氧厭氧各放一塊）及巧克力平板（置CO2條件下）。（3）革蘭染色：依據(jù)菌落和菌體形態(tài)、染色特征可初步判定。（4）抗生素敏感性判定：BRBA平板上分區(qū)劃線接種，第一劃線區(qū)貼多粘菌素（10μg/片）、卡那霉素（1000μg/片）和萬古霉素（5μg/片）。厭氧菌純培養(yǎng)抑菌環(huán)直徑>=10mm為敏感。厭氧菌的分離和鑒定第18頁表1Ⅱ級水平試驗(yàn)室革蘭陰性厭氧菌群、屬、種判定_________________________________________________________________________________厭氧菌種類細(xì)胞卡那萬古多粘20%靛基質(zhì)脂酶硝酸鹽尿素酶動(dòng)力凹痕磚紅色形態(tài)霉素霉素菌素膽汁還原熒光_________________________________________________________________________________脆弱類桿菌群BRRR+V——其它類桿菌BRRV—V——+—產(chǎn)色素桿菌.RVV—VVP.中間型桿菌CB/BRRS—++-+-PloescheiiRRV———+類解脲類桿菌群SRS———+VVV—解脲類桿菌.BSRS——++—V梭狀肛菌屬SRSVVV—革蘭陰性球菌CSRSV韋榮球菌屬CSRS+—+_________________________________________________________________________________

R:耐藥，S:敏感，V:不定，C:球菌，B:桿菌，CB:球桿菌，P:Prevotella;*甲酸、延胡素酸鹽刺激生長陽性

厭氧菌的分離和鑒定第19頁表4-3Ⅱ級水平試驗(yàn)室革蘭陽性厭氧菌群、屬、種判定_______________________________________________________________________________________________________________厭氧菌種類細(xì)胞已醇芽卡那多粘萬古靛基質(zhì)硝酸鹽觸酶卵磷反向CA菌體列車雙環(huán)β尿素酶形態(tài)胞試驗(yàn)霉素菌素霉素還原脂酶MP試驗(yàn)狀排列溶血現(xiàn)象_______________________________________________________________________________________________________________厭氧革蘭陽性球菌C—VRSV厭氧消化球菌C/CB—RSRS——+V不解糖消化球菌C—SRS+梭狀芽胞桿菌屬B+VRSV奈格爾試驗(yàn)陽性梭芽胞菌B+SRS+產(chǎn)氣莢膜梭菌B+SRS—++++雙酶梭菌B+SRS—+————索氏梭菌B+SRS—+———+奈格