生物藥品概論

生物藥品概論1第1頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六近些年來，伴隨著生物化學、醫(yī)藥學的蓬勃發(fā)展，在臨床上愈來愈多地應用氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、酶及輔酶、糖類、脂類等生物體內(nèi)的生化基本物質(zhì)，預防、診斷和治療多種疾病，并取得了令人鼓舞的效果。蛋白質(zhì)、糖類、脂類是生物體內(nèi)的基本組成物質(zhì)和主要能量來源。第2頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六生命的基本特征是蛋白質(zhì)的自我更新，生命的許多現(xiàn)象，如神經(jīng)感受性、肌肉收縮、生長繁殖、免疫反應等都以蛋白質(zhì)為物質(zhì)基礎，氨基酸則是組成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)；核酸在體內(nèi)起指導各種特異蛋白質(zhì)合成的作用，與生長、發(fā)育、繁殖、遺傳、變異都有著極為密切的關系；酶是生物體內(nèi)的催化劑，參與一切代謝過程；激素是體內(nèi)各種化學反應的速度、方向以及相互關系的“自控調(diào)節(jié)器”。第3頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六第一節(jié)生物藥物的研究范圍一、生物藥物的歷史與現(xiàn)狀

早期階段生物藥物多來自動物臟器，但有效成分不明。

上世紀二十年代到本世紀末

對動物臟器有效成分逐漸明確，從生物體分離、純化酶制劑的技術日益成熟，酶類藥物廣泛應用；并且各種激素類藥物和疫苗等迅速發(fā)展。此外，應用酶工程技術、細胞工程技術和基因工程技術生產(chǎn)抗生素、氨基酸和植物次生代謝產(chǎn)物進入產(chǎn)業(yè)化階段。

本世紀廣泛應用現(xiàn)代生物技術開發(fā)各類新型藥物和改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)。第4頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六生化藥物的發(fā)展幾乎是伴隨著生物化學的發(fā)展，生物化學史也就是生化藥物史。生物化學是生命科學中最古老的學科之一（遺傳學、細胞學）。18世紀，一些從事化學研究的科學家，如拉瓦錫、舍勒等人和一些藥劑師、煉丹師轉(zhuǎn)向生物領域，這就為生物化學的誕生播下了種子。這時生物學就逐漸分離成生理化學、遺傳學、細胞學。19世紀末，又從生理化學中分離出生物化學20世紀中后期又從生物化學中分離出分子生物學第5頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六1、生化藥物發(fā)展概況

迄今為止，生化藥物按照其產(chǎn)品純度、工藝特點和臨床療效大體經(jīng)歷了三個發(fā)展階段，一些利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質(zhì)與其他共存成分相混合的制劑于20世紀50～70年代相繼問世，例如利用牛、羊膽酸與膽紅素等制成的人工牛黃，利用牛羊新鮮眼球制成的眼明注射液、滴眼液(現(xiàn)國家標準更名為眼氨肽注射液、滴眼液)，利用胎盤生產(chǎn)的胎盤注射液及胎盤片，利用豬腸黏膜生產(chǎn)的肝素鈣和腸多糖，利用動物的喉骨或軟骨組織生產(chǎn)的硫酸軟骨素，利用銀耳生產(chǎn)的銀耳口服液等。上述藥物約有數(shù)十個品種。由于療效尚可，加之質(zhì)量標準的不斷提高

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具體運用生物化學研究方法，從生物體中經(jīng)提取、分離、純化等手段獲得的天然存在的生化活性物質(zhì)或?qū)⑸鲜鲞@些物質(zhì)加以結構改造或人工合成創(chuàng)造出的自然界沒有的新的活性物質(zhì)，通稱生化藥物(Biochemicalmedicine)。第7頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六二生化藥品的分類按照制品的純度，工藝特點和臨床療效特征，生化藥物的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段：第一代是利用生物材料加工的含有某些天然活性物質(zhì)與混合成分的粗制劑；第二代生化藥物是根據(jù)生物化學和免疫學原理，應用近代生化分離、純化技術從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分；第三代生化藥物是應用生物工程技術生產(chǎn)的天然生物活性物質(zhì)以及通過蛋白質(zhì)工程原理設計制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物或與天然品結構不同的全新的藥理活性成分。第8頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六氨基酸類藥物：個別氨基酸制劑和復方氨基酸制劑；

多肽和蛋白質(zhì)類藥物：多肽在生物體內(nèi)活性很強，對調(diào)節(jié)生理功能有重要作用；蛋白質(zhì)類藥由單純蛋白質(zhì)和結合蛋白質(zhì)兩類；酶與輔酶類藥物：酶類藥物有助消化酶類、消炎酶類、心血管疾病治療酶、抗腫瘤酶類和輔酶類藥物；核酸及其降解物和衍生物：核酸類、多聚核苷酸、核苷、核苷酸及其衍生物；第9頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六多糖類藥物：在抗凝、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫功能和抗衰老方面具有較強的藥理作用；脂類藥物：磷脂類、多價不飽和脂肪酸和前列腺素、膽酸類、固醇類和噗啉類；細胞生長因子與組織制劑：這類制劑藥效成分不完全清楚，但對某些疾病卻有一定療效；第10頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六十大熱門生物技術第11頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六所謂疾病，主要是機體因內(nèi)外環(huán)境改變時無法適應，而發(fā)生代謝失常，使起控制、調(diào)節(jié)作用的酶，激素．核酸以及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)自身或環(huán)境發(fā)生故障；如酶作用的失控，會使產(chǎn)物過多積累而造成中毒或底物大量消耗而得不到補償，或激素分泌紊亂或免疫功能下降或基因表達調(diào)控失靈等。第12頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六如果把上述生物體內(nèi)的各種基本物質(zhì)用來補充、調(diào)整、增強、抑制、替換或糾正人體代謝的失調(diào)，則對疾病的治療就比較合理了。現(xiàn)在，這些具有生物活性的生化基本物質(zhì)和某些已知的化學結構，經(jīng)過人工改造或合成而獲得了一些比較理想的新藥，巳經(jīng)成了臨床治療上不可缺少的藥物.第13頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六目前人類所要克服的主要疾病有：（1）腫瘤。在全世界腫瘤死亡率居首位，美國每年用于腫瘤的治療費用高達1020億美元；（2）神經(jīng)退化性疾病。老年癡呆癥、帕金森氏病、腦中風及脊椎外傷的生物技術藥物治療；（3）自身免疫性疾病。許多炎癥由自身免疫缺陷引起，如哮喘、風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、紅斑狼瘡等。世界上風濕性關節(jié)炎患者多于4000萬，每年用于治療風濕性關節(jié)炎的醫(yī)療費達上千億美元，一些制藥公司正在積極攻克這類疾病；第14頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六（4）冠心病。美國有100萬人死于冠心病，每年治療費用高于1170億美元。今后10年，防治冠心病的藥物將是制藥工業(yè)的重要增長點；(5)病毒感染性疾病。無論是談“艾（AIDS）”色變還是談“薩（SARS）”色變的現(xiàn)象都使人們意識到病毒感染性疾病對人類的巨大威脅。人類甚至連相對比較溫和的感冒病毒、乙肝病毒（HBV）都難以戰(zhàn)勝。從另一角度講，解決這些疾病為藥物科學與技術的發(fā)展提供了契機，針對這些疾病的藥物研發(fā)將是未來藥學界和制藥業(yè)的研究熱點和重點第15頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六第二節(jié)生化藥物特點1．生物原材料的復雜性生物材料的復雜性主要表現(xiàn)在以下方面：①同一種生化物質(zhì)的原料可來源于不同生物體如人、動物、微生物、植物、海洋生物等；②同一種物質(zhì)也可由同種生物體的不同組織，器官、細胞產(chǎn)生，如在豬胰臟和豬的頜下腺中都有血管舒緩素并且從兩者獲得的血管舒緩素并無生物學功能的差別；③同一種生物體或組織可產(chǎn)生結構完全不同的物質(zhì)及結構相似物質(zhì)。由此也造成對制備技術要求的多樣性和復雜性。第16頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六2．生化物質(zhì)種類多、有效成分含量低生物原材料中的生化成分組成復雜，種類多，有效成分含量低，雜質(zhì)多，尤其是那些生物活性越高的成分，含量往往越低，如胰島素在胰臟中的含量約為萬分之二，脫氧核糖核酸酶的含量約為十萬分之四。并且雜質(zhì)與目的物的性質(zhì)如溶解度、相對分子質(zhì)量、等電點都十分相近，使得分離純化比較困難。所以，直接從生物材料提取含量極低的生理活性物質(zhì)，沒有太大的工業(yè)價值。而這正是現(xiàn)代生物技術的重點開發(fā)領域。第17頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六3．生物材料的種屬特性．由于生物體間存在著種屬特性關系，因而，使許多內(nèi)源性生理活性物質(zhì)的應用受到了限制。如用人腦垂體分泌的生長素治療侏儒癥有特效，但用豬腦垂體制備的生長素則對人體無效；牛胰中提取的牛胰島素單位比豬胰島素高，牛為40000lU／kg，豬為30001U／kg。而抗原性則豬胰島素比牛胰島素低，豬胰島素與人胰島素只有一個氨基酸差異，而牛胰島素有三個氨基酸差異。由動物細胞產(chǎn)生的干擾素與人干擾素有抗原交叉反應，而對一些非同源性動物的某些細胞的抗病毒活性作用并不下降。第18頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六4．藥物活性與分子空間構象相關生化成分中的大分子物質(zhì)都是以其嚴格的空間構象維持其生物活性功能的，原有的構象一旦發(fā)生變化，其生理活性就完全喪失。引起活性破壞的因素有生物性因素的破壞(如被自身或污染的微生物的酶所破壞)、理化因素的破壞(如pH值、溫度、剪切力、重金屬、壓力等)，因而對生產(chǎn)、制劑、貯存、運輸?shù)冗^程條件的控制有較高的要求。第19頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六5．對制備技術條件要求高由于生物材料及產(chǎn)品的特殊性，對其生產(chǎn)技術、生產(chǎn)條件、檢測方法、檢測內(nèi)容及生產(chǎn)人員都有較高的要求：①不管是原料還是產(chǎn)品均為高營養(yǎng)物質(zhì)，極易染菌腐敗，因而對原料的采集、保藏、產(chǎn)品的生產(chǎn)等都有溫度和無菌條件的要求；②因有效成分含量低、穩(wěn)定性差等對生產(chǎn)過程中的pH值、溫度、剪切力、重金屬含量、壓力等操作條件均需嚴格控制；第20頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六③檢測內(nèi)容不但要有理化檢測指標更要求有生物活性檢驗指標，對生物技術藥物還需有工程菌(細胞)的各種分析資料及產(chǎn)物的鑒定分析資料；④檢測方法要求重現(xiàn)性好，有較高的靈敏度高和專屬性；⑤要求生產(chǎn)、管理人員具備一定的知識深度和相當?shù)闹R結構。第21頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六第三節(jié)傳統(tǒng)生化制藥的一般工藝過程一、生物材料的選擇與保存(一)材料的選擇傳統(tǒng)生化藥物主要是來源于動物器官、組織、血液經(jīng)提取獲得的一大類內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。傳統(tǒng)生化藥品的制造主要包括以下工藝過程：生物材料的選取與預處理----提取有活性部分----有效成分的分離、純化----制劑一、生物材料的選擇與保存(一)材料的選擇選取生物材料時需考慮其來源、目的物含量、雜質(zhì)的種類、價格、材料的種屬特性等，其原則是要選擇富含所需目的物、易于獲得、易于提取的無害生物材料。第22頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六1.來源選材時應選用來源豐富的生物材料，做到盡量不與其他產(chǎn)品爭原料，且最好能綜合利用。如用胰臟生產(chǎn)彈性蛋白酶、激肽釋放酶、胰島素與胰酶等；用人胎盤生產(chǎn)r-球蛋白、胎盤白蛋白、胎盤脂多糖及胎盤水解物；用人尿生產(chǎn)尿激酶、HCG等；用豬心生產(chǎn)細胞色素C和輔酶Q10等。第23頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六第24頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六2.與有效成分含量相關的因素(二)材料的采集與保存1．天然生物材料的保存由于生理活性物質(zhì)易失活、降解，所以采集時必須保持材料的新鮮防止腐敗、變質(zhì)與微生物污染。如胰臟采摘后要立即速凍，防止胰島素活力下降；膽汁在空氣中久置，會造成膽紅素氧化；提取酶原要及時,止酶原被激活轉(zhuǎn)變?yōu)槊?。因此生物材料的采摘必須新鮮、快速，及時速凍，低溫保存。保存生物材料的方法主要有速凍、凍干、有機溶劑脫水，如制成“丙酮粉”或浸存于丙酮與甘油中等第25頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六2．動物細胞的保存方法及影響保存質(zhì)量的因素(1)保存方法動物細胞培養(yǎng)技術是1907年R．G·帕拉遜在試管內(nèi)對蛙的神經(jīng)組織培養(yǎng)成功后建立的，以后陸續(xù)成功地培養(yǎng)了哺乳動物、昆蟲、魚類等各種動物細胞。利用培養(yǎng)的細胞生產(chǎn)疫苗、干擾素、尿激酶、促紅細胞生成素和單克隆抗體等已進入工業(yè)化生產(chǎn)。動物細胞的保存方法有組織塊保存，細胞懸液保存，單層細胞保存及低溫冷凍保存等。第26頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六①組織塊保存法胚胎組織塊比成體組織塊易保存。胚胎組織如人胚胎腎塊在4~C可保存2周，長者可達1個月。其方法是取出新生胎兒腎臟剪成小塊，洗滌后加生長培養(yǎng)液，于4~C過夜，換液一次，可置冰瓶轉(zhuǎn)送他地。第27頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六②細胞懸液保存法在一定條件下，細胞懸液可短期保存，不同種類的細胞保存條件亦異，通常于4℃，在生長培養(yǎng)液中可保存數(shù)日或數(shù)周。如用胰蛋白酶分散的新鮮猴腎細胞懸液，在4℃保存10-24h后，離心收集細胞，用新鮮生長培養(yǎng)液再懸浮，于4℃至少可保存3周。第28頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六③單層細胞保存法本法是通過降低溫度來延長細胞的正常代謝時間，保存過程中經(jīng)常更換生長培養(yǎng)液可提高保存的效果。如人羊膜細胞28℃可保存1個月；人二倍體細胞30℃可保存2周，中間換液可保存1個月。若生長培養(yǎng)液中牛血清減到0.5％-1％，37℃培養(yǎng)，并有規(guī)律更換生長培養(yǎng)液，可長期保存。④低溫冷凍保存將細胞凍存于-70℃的低溫冰箱中或液氮中。在低溫冰箱中可凍存1年以上，在液氮中可長期保存。第29頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(2)影響保存質(zhì)量的因素①細胞的凍存速度生理濃度鹽溶液在-0.5-0.6℃時開始結冰，若溫度急速下降則胞內(nèi)外一起結冰，可破壞細胞結構，造成細胞死亡，故降溫速度應緩慢，先使細胞間隙結冰，將胞內(nèi)水分慢慢吸出，細胞的脫水程度將達到90％以上。溫度以1-5℃／min的速度下降，獲得的生存率最高。復蘇時可加溫加速融化，細胞吸收水分，結構與功能不受影響。第30頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六②保護劑細胞凍結的保護劑有甘油及二甲基亞砜(DMSO)。甘油能結合水，減少組織結凍量，防止胞內(nèi)鹽濃度上升，使組織慢慢凍結，并能增加細胞膜通透性，而且毒性小對細胞有保護作用。甘油的使用濃度依不同組織而定，一般在5％-20％之間。DMSO比甘油更能防止細胞凍傷，通透性更高，黏度更低，毒性更小。細胞在DMSO中30s-10min即可達到內(nèi)外平衡。DMSO常用濃度為5％-12.5％，使用時應注意DMSO的質(zhì)量，要用蒸汽高壓消毒。復蘇時含0．5%-1％DMSO不影響細胞生長。第31頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六③凍結方法準備傳代的單層細胞可進行凍存。操作方法是用常規(guī)方法消化分散細胞，離心收集(800r／min)，按每毫升5X106個細胞濃度添加保護劑(保護劑是在生長液中加入8%-10%DMSO、15％-20％牛血清及適量NaHC03配成，也可添加適量抗生素)，然后以1mL量分裝于2mL的保存瓶中，在0-4℃預凍2-4h，搖勻，置于-70℃冰箱凍存。也可先置于液氮罐氣相中過夜，再浸入液相中(-196℃)保存?；?qū)?70℃凍存過夜的細胞保存瓶直接浸入液氮中存放。第32頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六④凍存細胞的復蘇細胞傳代培養(yǎng)前，要先使凍存細胞融化復蘇。其過程為取出凍存細胞保存瓶，立即用4層紗布包好。浸入40℃水中片刻，防止炸裂，去掉紗布，浸入水中搖融40s，混勻后立刻接種到1-2個培養(yǎng)瓶中，按等量稀釋法加人生長液使成為20mL。如用DMSO為保護劑即可直接接種，但DMSO必須在生長液中被稀釋10倍以上。若保護劑是甘油，即應離心收集細胞，除去甘油后再接種。加完生長培養(yǎng)液后，取樣計活細胞數(shù)，用臺酚藍染色，死者為藍色。于37℃培養(yǎng)4-18h后換液，然后轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)。第33頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六二、生物材料的預處理(一)組織與細胞的破碎1．物理法(1)磨切法工業(yè)上常用的有絞肉機、刨胰機、膠體磨、球磨機、萬能磨粉機。實驗室常用的有勻漿器、乳缽、高速組織搗碎機。用乳缽時，常加入玻璃粉、氧化鋁等助磨劑。第34頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(2)壓力法有滲透壓法，高壓法和減壓法。高壓法是用幾百萬至幾千萬壓力反復沖擊物料。減壓法是對菌體緩緩加壓，使氣體溶入細胞，然后迅速減壓使細胞破裂。滲透壓法是使細胞在濃鹽中平衡，再投入水中膨脹破裂。(3)震蕩法用超聲波震蕩破碎細菌細胞，頻率為10一200kHz。該法產(chǎn)熱較多，要注意冷卻。第35頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(4)凍融法將材料先在一15℃以下凍結，再使其融化，反復操作使細胞與菌體破碎。2.化學法用稀酸、稀堿、濃鹽、有機溶劑或表面活性劑(如膽酸鹽、氧化十二烷基吡啶)處理細胞，可使細胞結構破壞，釋放出內(nèi)容物。第36頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六3．生物法(1)組織自溶法利用組織中自身酶的作用，改變、破壞細胞結構，釋放出目的物，稱為組織自溶。自溶過程酶原被激活為酶，既便于提取，又提高了效率，但不適用于易受酶降解的目的物的提取。第37頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(2)酶解法用外來酶處理生物材料，如用溶菌酶處理某些細菌，用胰酶處理豬腦生產(chǎn)腦安泰等。用作專一性分解細胞壁的酶還有細菌蛋白酶、纖維素酶、蝸牛酶、酯酶、殼聚糖(3)噬菌體法用噬菌體感染細菌、裂解細胞，釋放出內(nèi)容物。此法較少應用。第38頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(二)細胞器的分離為獲得結合在細胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先獲得特定的細胞器，再進一步分離目的產(chǎn)物。方法是勻漿破碎細胞，離心分離，包括差迷離心和密度梯度離心?，F(xiàn)以大鼠肝細胞勻漿的差迷離心分離各種細胞器為例加以說明，見圖9—1。第39頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六第40頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六對所得細胞器的含量與純度可用電鏡觀察，用免疫法分析某種特定物質(zhì)的含量或用“標志酶”法分析特定酶類的濃度予以確定。如線粒體可測定琥珀酸脫氫酶，微粒體可測定NADPH(輔酶Ⅱ)細胞色素C還原酶，細胞膜可測定Na、K-ATP酶，細胞核可測定DNA合成酶。第41頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(三)制備丙酮粉在生化物質(zhì)提取前，有時還有用丙酮處理原材料，制成“丙酮粉”，其作用是使材料脫水、脫脂，使細胞結構松散，增加了某些物質(zhì)的穩(wěn)定性，有利于提取，同時又減少了體積，便于貯存和運輸。而且應用“丙酮粉”提取可以減少提取液的乳化程度及黏度，有利于離心與過濾操作。同時，有機溶劑既能抑制微生物的生長和某些酶的作用，防止目的物降解失活，又能阻止大量無關蛋白質(zhì)的溶出，有利于進一步純化。第42頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六三、生物活性物質(zhì)的提取提取是利用制備目的物的溶解特性，將目的物與細胞的固形成分或其他結合成分分離，使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境的過程。生物活性物質(zhì)的提取常用浸漬法(用冷溶劑溶出固體材料中的物質(zhì))與浸煮法(用熱溶劑溶出目的物)。第43頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(一)提取方法的選擇及注意的問題提取是分離純化活性物質(zhì)的第一步，其目的和作用是除去與目的物性質(zhì)差異大的雜質(zhì)，濃縮目的物。要獲得好的提取效果，最重要的是針對生物材料和目的物的性質(zhì)選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。常用的提取方法是固液提取，常用的溶劑是水。生物材料和目的物與提取有關的一些性狀包括目的產(chǎn)物的溶解性質(zhì)、相對分子質(zhì)量、等電點、存在方式、穩(wěn)定性、相對密度、粒度、黏度、含量、主要雜質(zhì)種類及性質(zhì)、相關酶類的特性等。其中最主要的是目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。設計者可根據(jù)文獻資料及試驗結果獲得有關信息，選擇、設計合適的方法和條件。第44頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六在提取過程中盡量增加目的物的溶出度、減少雜質(zhì)的溶出度，同時關注生物材料及目的物在提取過程中的活性變化。對酶類藥物的提取要防止輔酶的丟失和其他失活因素的干擾；對蛋白質(zhì)類藥物要防止其高級結構的破壞，應避免高熱、強烈攪拌、大量泡沫、強酸、強堿及重金屬離子等不利因素對其空間構象的影響；多肽類及核酸類藥物需注意避免酶的降解作用，并添加某些酶抑制劑；對脂類藥物應特別注意防止氧化，減少與空氣接觸等措施，如添加抗氧劑、通氮氣及避光等。提取過程，應在低溫、無菌條件下進行。

第45頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六水是提取生化物質(zhì)的常用溶劑。水是高度極化的極性分子，具有很高的介電常數(shù)。在水溶液中，水分子自身形成氫鍵的趨勢很強，有極高的分子內(nèi)聚力(締合力)。水分子的存在可使其他生物分子間(包括同種分子與異種分子)的氫鍵減弱，而與水分子形成氫鍵，水分子還能使溶質(zhì)分子的離子鍵解離，這就是所謂“水合作用”。水合作用促使蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子與水形成了水合分子或水合離子；從而促使它們?nèi)芙庥谒蛩芤褐?。?6頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(二)活性物質(zhì)的保護措施在提取過程中，保持目的物的生物活性十分重要，對于一些生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物常采用下列保護措施。(1)采用緩沖系統(tǒng)提取溶劑采用緩沖系統(tǒng)，防止提取過程中某些酸堿基團的解離導致溶液pH值的大幅度變化，使某些活性物質(zhì)變性失活，或因pH值變化影響提取效果。在生化藥物制備中，常用的緩沖系統(tǒng)有磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、tris緩沖液、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液和巴比妥緩沖液等，所使用的緩沖液濃度較低，以利于增加溶質(zhì)的溶解性能。第47頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(2)添加保護劑為防止某些生理活性物質(zhì)活性基團及酶活性中心受破壞(如巰基是許多活性蛋白質(zhì)和酶的催化活性基團，極易被氧化)，故提取時常添加某些還原劑(如半胱氨酸，α—巰基乙醇，二巰基赤蘚糖醇，還原型谷胱甘肽等)。提取某些酶時常加入適量底物以保護活性中心。對易受重金屬離子抑制的活性物質(zhì)，可在提取時添加某些金屬螯合劑，以保護活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。第48頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(3)抑制水解酶的作用抑制水解酶活力是提取操作中的最重要的保護性措施之一?？筛鶕?jù)不同水解酶的性質(zhì)采用不同方法：需要金屬離子激活的水解酶(如DNAse)常加入EDTA或用檸檬酸緩沖液，以降低或除去金屬離子使酶活力受到抑制；對熱不穩(wěn)定的水解酶，可選擇熱變性提取法，使酶失活；根據(jù)酶的溶解性質(zhì)的不同，還可用pH值不同的緩沖體系提取，以減少酶的釋放或根據(jù)酶的最適pH值，選用酶發(fā)揮活力最低的pH值進行提取。第49頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六最有效的辦法是在提取時，添加酶抑制劑，以抑制水解酶的活力。如提取RNA時添加核糖核酸酶抑制劑，常用的有十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、萘-1,5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉、4-氨基水楊酸鈉以及皂土、肝素、DEP(二乙基焦碳酸鹽)、蛋白酶K等。第50頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(4)其他保護措施為了保持某些生物大分子的活性，也要注意避免紫外線、強烈攪拌、過酸、過堿或高溫、高頻震蕩等。有些活性物質(zhì)還應防止氧化，如固氮酶、銅—鐵蛋白提取分離時要求在無氧條件下進行；有些活性蛋白對冷、熱變化也十分敏感，如免疫球蛋白就不宜在低溫凍結。所以提取時要根據(jù)目的物的不同性質(zhì)，具體對待。第51頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(三)影響提取的因素1．溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度隨提取溫度的升高而增加，另外較高的溫度可以降低物料的黏度，有利于分子擴散和機械攪拌。所以對一些植物成分、某些較耐熱的生化成分(如多糖類)，可以用浸煮法提取，加熱溫度一般為50—90~C。但對大多數(shù)不耐熱生物活性物質(zhì)不宜采用浸煮法，一般在0—10C進行提取。對一些熱穩(wěn)定性較好的成分，如胰彈性蛋白酶可在20—25℃提取。有些生化物質(zhì)在提取時，需要酶解激活，如胃蛋白酶的提取，溫度可以控制在30一40℃。應用有機溶劑提取生化成分時，一般在較低的溫度下進行提取，一方面是為了減少溶劑揮發(fā)損失和生產(chǎn)安全，另一方面也是為了減少活力損失。第52頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六2．酸堿度多數(shù)生化物質(zhì)在中性條件下較穩(wěn)定，所以提取用的溶劑系統(tǒng)原則上應避免過酸或過堿，pH值一般應控制在4—9范圍內(nèi)。為了增加目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等電點附近進行提取。有些生化物質(zhì)在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，且稀酸又有破壞細胞的作用，所以有些酶(如胰蛋白酶、彈性蛋白酶及胰島素等)都在偏酸性介質(zhì)中進行提取。多糖類物質(zhì)因在堿性環(huán)境中更穩(wěn)定，故多用堿性溶劑系統(tǒng)提取多糖類藥物。巧妙地選擇溶劑系統(tǒng)的pH值不但可直接影響目的物與雜質(zhì)的溶解度，還可以抑制有害酶類的水解破壞作用，防止降解，提高收得率。對于小分子脂溶性物質(zhì)而言，調(diào)節(jié)適當?shù)娜軇﹑H值還可使其轉(zhuǎn)入有機相中，便于與水溶性雜質(zhì)分離。第53頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六3．鹽濃度鹽離子的存在能減弱生物分子間離子鍵及氫鍵的作用力。稀鹽溶液對蛋白質(zhì)等生物大分子有助溶作用。一些不溶于純水的球蛋白在稀鹽中能增加溶解度，這是由于鹽離子作用于生物大分子表面，增加了表面電荷，使之極性增加，水合作用增強，促使其形成穩(wěn)定的雙電層，此現(xiàn)象稱“鹽溶”作用。多種鹽溶液的鹽溶能力既與其濃度有關，也與其離子強度有關，一般高價酸鹽的鹽溶作用比單價酸鹽的鹽溶作用強。常用的稀鹽提取液有：氯化鈉溶液(0．1—0．15mol／L)；磷酸鹽緩沖液(0．02—0．05mol／L)；焦磷酸鈉緩沖液(0．02—0．05mol／L)；醋酸鹽緩沖液(0．10—0．15mol／L)；檸檬酸緩沖液(0．02—0．05mol／L)。其中焦磷酸鹽的緩沖范圍較大，對氫鍵和離子鍵有較強的解離作用，還能結合二價離子，對某些生化物質(zhì)有保護作用。檸檬酸緩沖液常在酸性條件下使用，作用效果近似焦磷酸鹽。第54頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(四)常用的提取方法1.用酸、堿、鹽水溶液提取用酸、堿、鹽水溶液可以提取各種水溶性、鹽溶液的生化物質(zhì)。這類溶劑提供了一定的離子強度、pH值及相當?shù)木彌_能力。如胰蛋白酶用稀硫酸提?。桓嗡赜胮H＝9的3％氯化鈉溶液提取。對某些與細胞結構結合牢固的生物大分子，在提取時采用高濃度鹽溶液(如4mol／L鹽酸胍，8mol／L脲或其他變性劑)，這種方法稱“鹽解”。第55頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六2．用表面活性劑提取表面活性劑分子兼有親水與疏水基團，分布于水油界面時有分散、乳化和增溶作用。表面活性劑又稱“去垢劑”?？煞譃殛庪x子型、陽離子型、中性與非離子型去垢劑。離子型表面活性劑作用強，但易引起蛋白質(zhì)等生物大分子的變性，非離子型表面活性劑變性作用小，適合于用水、鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質(zhì)或酶的提取。某些陰離子去垢劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)等可以破壞核酸與蛋白質(zhì)的離子鍵合，對核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。使用去垢劑時應注意它的親油、親水性能的強弱。第56頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六3．有機溶劑提取用有機溶劑提取生化物質(zhì)可分為固—液提取和液—液提取(萃取)兩類。(1)固—液提取常用于水不溶性的脂類、脂蛋白、膜蛋白結合酶等。例如用丙酮從動物腦中提取膽固醇，用醇醚混合物提取輔酶Q10，用氯仿提取膽紅素等。有機溶劑在提取目的物時，可以用單一溶劑提取法，也可用多種溶劑組合提取。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等極性溶劑以及乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑。極性溶劑既有親水基團又有疏水基團，從廣義上說，也是一種表面活性劑。乙醚、氯仿、苯是脂質(zhì)類化合物的良好溶劑。第57頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六在選用有機溶劑時一般采用“相似相溶”的原則。如丁醇在水中有一定溶解度，對細胞膜上磷脂蛋白的溶解能力強，能迅速透人酶的脂質(zhì)復合物中。所以對那些與細胞顆粒結構如線粒體等結合的酶，或與脂類物質(zhì)緊密結合的活性物質(zhì)，采用丁醇為溶劑，效果較好。丁醇也能用于干燥生物材料的脫脂，但它在水溶液中解離脂蛋白的能力更強。第58頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(2)液—液萃取液—液萃取是利用溶質(zhì)在兩個互不混溶的溶劑中溶解度的差異，將溶質(zhì)從一個溶劑相向另一個溶劑相轉(zhuǎn)移的操作。影響液—液萃取的因素主要有目的物在兩相的分配系數(shù)(K)和有機溶劑的用量等。分配系數(shù)K值增大，提取效率也增大，萃取就易于進行完全。當物質(zhì)的K值較小時，可以適當增加有機溶劑用量來提高萃取率。但有機溶劑用量增加會增加后處理的工作量，因此在實際工作中，常常采取分次加入溶劑，連續(xù)多次提取來提高萃取率。第59頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六四、生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥(一)生物活性物質(zhì)的濃縮(1)鹽析濃縮(2)有機溶劑沉淀濃縮(3)用葡聚糖凝膠(Sephadex)濃縮(4)用聚乙二醇濃縮(5)超濾濃縮(6)真空減壓濃縮與薄膜濃縮第60頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六大型薄膜蒸發(fā)器示意第61頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六第62頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(二)干燥干燥是使物質(zhì)從固體或半固體狀經(jīng)除去存在的水分或其他溶劑，從而獲得干燥物品的過程·在生化制藥工藝中干燥目的在于：①提高藥物或藥劑的穩(wěn)定性，以利保存與運輸；②使藥物或藥劑有一定的規(guī)格標準；③便于進一步處理。水在干燥的物料中，有三種存在形式：即表面水、毛細管中的水與細胞內(nèi)的水。表面水很容易通過汽化除去。毛細管中的水，由于毛細管壁的作用，較難除去。細胞內(nèi)的水由于被細胞膜包圍封閉，如不擴散到膜外則不容易蒸發(fā)除去。水分在固體物料中的存在情況可能是單一的，也可能是多樣的，因此，干燥應緩慢進行，使各種形成存在水能被逐步去除。干燥速度在溫度及壓力不變的條件下取決于液體到達表面的速度。物質(zhì)在空氣中的干燥度，常稱為物質(zhì)的平衡濕度，在一定條件下是一個定值。因此，除非改變大氣的溫度、濕度或壓力，否則即使無限地延長干燥的時間也不能改變物質(zhì)干燥度第63頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六五、生化物質(zhì)的分離純化(一)生物制藥中分離純化的特點在生化分離技術中包括生化分離分析和生化制備。前者主要對生物體內(nèi)各組分分離后進行定性、定量分析，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來。而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分第64頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六①生物材料組成非常復雜，一種生物材料常含成千上萬種成分，各種化合物在形狀、相對分子質(zhì)量和理化性質(zhì)等方面都各不相同，且又相似，其中有不少化合物迄今還是未知物，而且生物活性物質(zhì)在分離過程中仍處于不斷代謝變化中，因此常無固定操作方法可循。②有些化合物在生物材料中含量極微，只有萬分之一、十萬分之一，甚至百萬分之一。因此分離操作步驟多，不易獲得高收率。③生物活性成分離開生物體后，易變性、失活，分離過程必須十分小心地保護這些化合物的生理活性，這也是生物制藥中分離、制備的難點。第65頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六④生物制藥中的分離方法幾乎都在溶液中進行，各種參數(shù)(溫度、pH值、離子強度等)對溶液中各種組分的綜合影響無固定性，以致許多實驗設計理論性不強，實驗結果常常帶有很大經(jīng)驗成分。因此，實驗要有一定的重現(xiàn)性，必須從材料、方法、條件及試劑藥品等嚴格地加以規(guī)定。⑤為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物制藥中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進行，即常說的“逐級分離”方法。為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)用幾個甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達到目的。因而操作時間長，工藝復雜，效率不高。近年發(fā)展起來的親和層析法具有從復雜生物組成中專一“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應用。第66頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(二)分離純化的基本原理①根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離。如差迷離心與超速離心、膜分離(透析，電滲析)與超濾法、凝膠過濾法等。②根據(jù)分子荷電性質(zhì)(帶電性)差異進行分離。如離子交換法、電泳法、等電聚焦法等。③根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法、等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法?！あ芨鶕?jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。⑤根據(jù)生物分子與其配體的特異親和性進行分離。如親和層析法、親和沉淀法。第67頁，共74頁，2023年，2月20日，星期六(三)分離純化的基本程序和實驗設計①確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法；②通過文獻了解制備物的理化性質(zhì)，進行穩(wěn)定性的預備試驗；③材料處理及抽提方法的選擇；④分離純化方法的