別嘌醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

別嘌醇聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影

響侯小梅;馮安勇;嚴(yán)海元;冷崇姣【摘要】目的研究別嘌醇(allopurinol,Allo)聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-Fu)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響.方法用不同質(zhì)量濃度和配伍的別嘌醇、5-Fu處理HepG2細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果單用別嘌醇對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有微弱的抑制作用;別嘌醇與5-Fu聯(lián)用能抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并具有質(zhì)量濃度(1~3pg/L)和時(shí)間(24,48,72h)依賴性，兩藥聯(lián)用比單用5-Fu時(shí)抑制率更高;別嘌醇與5-Fu聯(lián)用時(shí)HepG2細(xì)胞的凋亡率為39.17%,高于單用5-Fu的30.86%(P<0.05).結(jié)論別嘌醇與5-Fu聯(lián)用對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡具有增強(qiáng)作用.％ObjectiveTostudytheinfluenceofAllopurinolcombinedwith5-FluorouracilontheproliferationandapoptosisoflivercancerHepG2cells.MethodsTheHepG2cellsweretreatedbydifferentconcentrationsandcombinationsofAllopwrind,5-Fluo-rouracil.CCK-8wasusedtomeasureHepG2cellsproliferation,andflowcytometrywasusedtoexaminetheapoptosisofHepG2cells.ResultsTheinhibitionofHepG2cellsapoptosisreactedbyAllopurinolwasweak,incombinationinhibitedtheproliferationofHepG2cellsinatime(24,48,72h)andconcentrationdependent(1-3pg/L)manner.Allopurinolcombinedwith5-Fluorouracilhadstrongerinhibitoryeffectthanthatwasusedalone.TheapoptosisrateofHepG2cellsinthecombinationtreatmentgroupwas39.17%,whichwassignificantlyhigherthan30.86%inthe5-Fluorouracilgroup(P<0.05).ConclusionAllopurinolcombinedwith5-FluorouracilhasenhancedeffectontheproliferationandapoptosisofHepG2cells.【期刊名稱】《中國(guó)藥業(yè)》【年(卷)，期】2017(026)010【總頁(yè)數(shù)】3頁(yè)(P18-20)【關(guān)鍵詞】5-氟尿嘧啶;別嘌醇;HepG2細(xì)胞;增殖;凋亡【作者】侯小梅;馮安勇;嚴(yán)海元;冷崇姣【作者單位】重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶402160;重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院第三分院，重慶402160;重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶402160;重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶402160【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】R965.2;R979.1原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率高，發(fā)病率位居惡性腫瘤第3位。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)作為常規(guī)化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱化療)藥物長(zhǎng)期用于治療原發(fā)性肝癌，但化療藥物的非特異性及腫瘤的耐藥性會(huì)導(dǎo)致化療過(guò)程中產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且治療效果欠佳［1-4］。據(jù)報(bào)道，別嘌醇(allopurinol,Allo)配合5-Fu化療能有效減少5-Fu導(dǎo)致的膀胱炎、黏膜炎、骨髓毒性、神經(jīng)毒性等毒副反應(yīng)，化療前使用Allo也是預(yù)防腫瘤溶解綜合征的常規(guī)方法，Allo也是一種治療腫瘤的輔助常用藥［5-9］。本研究擬通過(guò)觀察Allo聯(lián)合5-Fu對(duì)HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用后的細(xì)胞和未處理細(xì)胞的凋亡率，探討Allo聯(lián)合5-Fu對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制，以減少不良反應(yīng)。1.1儀器與試藥酶標(biāo)儀（Sunrise，奧地利Tecan公司）；FACScan型流式細(xì)胞儀（Ecton-Dickinson公司）。人肝癌細(xì)胞株HepG2由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室提供;RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；Allo（北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)西南合成制藥股份有限公司，純度為99.8%，藥用級(jí)），用0.1mol/LNaOH溶液溶解后加RPMI1640培養(yǎng)液配制貯備液備用（pH=7.0）;5-Fu（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；CCK-8（東仁化學(xué)科技〈上海〉有限公司）；AnnexinV、碘化丙啶（PI,Sigma公司）。1.2方法HepG2細(xì)胞培養(yǎng)用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用不同質(zhì)量濃度Allo和5-Fu處理。HepG2細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)（CCK-8法）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞4x103/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100pLo培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，根據(jù)所加藥物濃度不同，分為5-Fu組、Allo組、聯(lián)合（Allo+5-Fu）組、空白組。用RPMI1640培養(yǎng)液配制藥物，藥物終質(zhì)量濃度：5-Fu組為250|jg/mL；Allo組為1,2,3|jg/mL；聯(lián)合組為1+250,2++250pg/mL；空白組加入等體積培養(yǎng)液，然后分別加入96孔培養(yǎng)板（每孔100"）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37C及5%CO2條件下分別培養(yǎng)24,36,48h。達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后，每孔加入CCK-810pL繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度（A450值），按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A450值/空白組平均A450值）x100%。HepG2細(xì)胞凋亡影響試驗(yàn)（流式細(xì)胞儀）將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度為5x103/mL的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2mL,共4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，用RPMI1640培養(yǎng)液配制藥物，藥物終質(zhì)量濃度：5-Fu組為250pg/mL;Allo組為3pg/mL;聯(lián)合組為3+250pg/mL,分別加入到6孔培養(yǎng)板(每孔2mL);空白組加入等體積培養(yǎng)液。于37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)48h,以1500r/min的速率離心7min，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)洗滌3次，最后1次移入1mI離心管中，加入AnnexinV、PI染色30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。PV0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用經(jīng)藥物處理24,48,72h后，250pg/mL的5-Fu可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，與空白組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1,2,3pg/mL不同質(zhì)量濃度組的Allo對(duì)HepG2細(xì)胞有微弱的抑制作用。當(dāng)5-Fu與不同質(zhì)量濃度的Allo聯(lián)用后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用有一定增強(qiáng)，與空白組及單用5-Fu組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。結(jié)果表明，Allo與5-Fu聯(lián)用有協(xié)同作用，可增強(qiáng)5-Fu對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。詳見(jiàn)表1。根據(jù)結(jié)果，建議選擇Allo為卻g/mL質(zhì)量濃度，因?yàn)槁?lián)合組，Allo質(zhì)量濃度差異對(duì)5-Fu的作用不顯著。2.2對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響各組藥物作用于HepG2細(xì)胞48h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀，用AnnexinV/PI染色后檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，5-Fu(250pg/mL)組和聯(lián)合組(3+250)細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡或壞死細(xì)胞較空白組均明顯增加，凋亡率分別上升為（30.86±1.72）%和（39.17±2.43）%，較空白組的（3.86±0.83）%差異顯著（P<0.05）。Allo組較空白組細(xì)胞早期凋亡略有增加（P<0.05），晚期凋亡或壞死細(xì)胞差異性不大（P>0.05）。兩藥聯(lián)用后，與單用5-Fu組相比，HepG2細(xì)胞的早期凋亡和凋亡率明顯增加（P<0.05），而晚期凋亡或壞死細(xì)胞增加不明顯（P>0.05），凋亡率差異顯著（P<0.05）。詳見(jiàn)表2和圖1。肝癌為常見(jiàn)的消化道腫瘤，具有高死亡率、早期癥狀隱匿、預(yù)后差等特點(diǎn)［10］。5-Fu作為抗腫瘤藥物已應(yīng)用多年，其臨床療效較差，但在目前消化道惡性腫瘤化療中仍為首選，在使用5-Fu常規(guī)劑量進(jìn)行化療時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)消化道不良反應(yīng)及骨髓抑制等不良反應(yīng)，這些都限制了5-Fu在肝癌治療中的應(yīng)用，怎樣合理應(yīng)用目前尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。因此，尋求一種與5-Fu聯(lián)用后能增強(qiáng)其作用效果，并減少其不良反應(yīng)的新型化療方案在對(duì)肝癌的治療上具有積極意義，如何解決化療藥物在治療過(guò)程中的耐藥性已成為肝癌治療的關(guān)鍵［11-13］。本研究通過(guò)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)觀察了Allo、5-Fu單藥及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，與空白組及5-Fu組相比，Allo對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用并不顯著，當(dāng)其與5-Fu聯(lián)合使用后，可明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖作用，提示二者具有協(xié)同增效作用。流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，5-Fu與Allo聯(lián)用的抑制率較5-Fu單用時(shí)明顯提高，存在抑制增殖機(jī)制，可能還存在促細(xì)胞凋亡機(jī)制。其機(jī)制可能是別嘌醇及其代謝產(chǎn)物異黃嘌呤均能抑制黃嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶是腫瘤增殖促進(jìn)劑，通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶從而抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡；其次，Allo也可提高肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性［14-15］，兩藥聯(lián)用起協(xié)同作用。但本研究?jī)H限于體外試驗(yàn)，與體內(nèi)具體情況有很大差異，且不同病理類型的肝癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性不同，因此其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】LauWY.Primaryhepatoeellularcareinoma[M].In:BlumgartLH&FongY.(2ndeds.)Surgeryof，TheLiverandBiliaryTractVolumeH,2000:1423-1450.于世英，胡國(guó)清.腫瘤臨床診療指南[M].北京：科學(xué)出版社，2005:164.LongleyDB,HarkinDP,JohnstonPG.5-Fluorouracilmechanismsofactionandclinicalstrategies[J].NatureReviewsCancer,2003,3(5):330-338.LeeNJ,KooJC,JuSS.Synthesisandbiologicalactivityofphathalimide-basedpolymerscontaining5-fluorouracilPolym[J].Int,2002,51(7):569-576.平成斌.別嘌醇的藥理作用及其臨床新用途[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2007,23(3):19-20.魏守順，陳湘龍，吳學(xué)杰別嘌醇預(yù)防5-FU治療膀胱腫瘤弓|起藥物性膀胱炎72例臨床觀察[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002,11(2):107.許偉穎.采用別嘌醇含漱預(yù)防5-氟尿嘧啶引起的口腔炎[J]護(hù)理學(xué)報(bào)，2008,15(6):70.MyersCE.Thepharmacologyofthefluoropyrimidines[J].PharmRev,1981,33(1):1-15.董小雄，彭紹珍，王玉增，等.別嘌醇降低氟尿嘧啶的實(shí)驗(yàn)研究[J].四川生理科學(xué)雜志，1988,10(2):40-44.王章桂，孫國(guó)平，徐淑萍，等.丹皮酚聯(lián)合阿霉素對(duì)HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用[J].腫瘤防治研究，2008,35(6):386-389.薛英威，耿敬姝，張豈凡.5-Fu不同作用方式對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2004,18(4):279-280.鐘琳.3種常用抗癌藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞