管理學FISH知識培訓

管理學FISH知識培訓第1頁/共33頁熒光原位雜交

（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）

FISH是一門新興的分子細胞遺傳學技術(shù)，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。靶DNA與標記有熒光基團的探針同源互補，經(jīng)變性--復性，形成雜交體，洗脫未結(jié)合的探針，在熒光顯微鏡下對雜交信號的大小、數(shù)目和分布等進行分析。第2頁/共33頁第3頁/共33頁

與熒光PCR的異同：

1.都有探針，但FISH是雜交探針，熒光PCR是

Taqman探針。

2.都是檢測核酸，但FISH保持了細胞的完整，熒光

PCR裂解細胞后再提取總DNA。

3.FISH直觀判斷單位細胞內(nèi)信號數(shù)的多少；熒光

PCR通過機器擴增后判斷拷貝數(shù)的多少。

4.都通過熒光檢測，F(xiàn)ISH是熒光顯微鏡，熒光PCR是熒光PCR儀。

5.FISH的檢測標本為石蠟切片，熒光PCR為血清、組織或細胞。第4頁/共33頁與其它常用技術(shù)比較：1.FISH敏感性雖略低于PCR法，但其假陽性或假陰性率卻大大低于PCR法，特異性更好。2.與免疫組織化學法（IHC）相比，F(xiàn)ISH具有良好的穩(wěn)定性和可重復性，檢測信號更強。第5頁/共33頁第6頁/共33頁第7頁/共33頁

FISH的優(yōu)點：

1.安全、快速

2.靈敏度及特異性高

3.探針能長期保存

4.雜交信號強且能同時顯示多種顏色

5.信號數(shù)目可量化，為數(shù)字化病理診斷打下基礎(chǔ)第8頁/共33頁第9頁/共33頁第10頁/共33頁公司目前FISH產(chǎn)品情況：1.膀胱癌CSP3/GSPP16基因檢測試劑盒已取得受理證號，今年6月左右可拿到注冊證；2.乳腺癌HER2（已報批，正開展后期臨床實驗驗證），今年4月可望拿到受理號；3.前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因檢測試劑盒（已初步完成研發(fā)階段，正準備報批程序）；4.正在開展乳腺癌TOP2A，宮頸癌TERC，非小細胞肺癌EGFR等三個產(chǎn)品研發(fā)；5.產(chǎn)前診斷試劑（21，13，18和性染色體）。第11頁/共33頁FISH實驗的基本試劑：

1.熒光探針；

2.甲酰胺；

3.氯化鈉；

4.檸檬酸鈉；

5.氫氧化鈉；

6.吐溫20。第12頁/共33頁FISH實驗的基本材料和設(shè)備：

1.暗房；

2.熒光顯微鏡（帶成像系統(tǒng)）；

3.恒溫水浴鍋；

4.培養(yǎng)箱；

5.染色缸；

6.載玻片；

7.移液器；

8.暗盒。第13頁/共33頁

實驗方法及步驟

1）樣品前處理

2）探針變性

3）標本變性

4）雜交

5）洗脫

6）封片

7）熒光顯微鏡觀察第14頁/共33頁變性雜交洗滌DAPI復染50%甲酰胺

2XSSC0.1%NP-4070%乙醇

探針變性標本變性70%甲酰胺73oC5min42oC

濕盒孵育過夜第15頁/共33頁FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用1.檢測的靶基因為Her-2:Her-2是乳腺癌細胞表面的受體，能控制癌細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，大約30%的乳腺癌病例表達水平增加，其高表達陽性乳腺癌是一種高危腫瘤，對常規(guī)的化療反應(yīng)性差，預(yù)后不好。2.赫賽汀治療Her-2高表達陽性乳腺癌：赫賽汀為治療性單抗，適用于治療Her-2過度表達的乳腺癌。第16頁/共33頁Her-2檢測推薦方法免疫組化（IHC）FISH

若IHC結(jié)果（＋＋），應(yīng)由FISH證實第17頁/共33頁結(jié)果分析正常細胞判斷：單個細胞紅色及綠色信號各2個異常細胞判斷：紅信號大于2為異常細胞，但綠色信號不少于2個。第18頁/共33頁結(jié)果判斷

計數(shù)30個細胞，統(tǒng)計Ratio值（Ratio值＝30個細胞核中紅信號總數(shù)/30個細胞核中綠信號總數(shù)）：

1）Ratio＜1.8為陰性結(jié)果，提示該樣本無Her-2基因擴增；

2）Ratio＞2.2為陽性結(jié)果，提示樣本中Her-2基因發(fā)生擴增；

3）Ratio在1.8-2.2之間時，可以選擇增加計數(shù)細胞至100個,或重做FISH實驗來判斷最終結(jié)果。第19頁/共33頁HER-2/CSP17>2.2（陽性結(jié)果）第20頁/共33頁

HER-2/CSP17<1.8（陰性結(jié)果）第21頁/共33頁HER-2/CSP17>2.2（陽性結(jié)果）第22頁/共33頁HER-2/CSP17<1.8（陰性結(jié)果）第23頁/共33頁FISH技術(shù)在前列腺癌診斷中的應(yīng)用1.80%左右前列腺癌存在TMPRSS2與ETS基因家族的融合改變；2.TMPRSS2：21q22.2，為男性雄激素調(diào)節(jié)基因；3.ETS家族為E26轉(zhuǎn)化特異性基因，包括:

ERG(21q22.3)、ETV1(7p21.2)、ETV4(17q21)第24頁/共33頁4.FISH檢測TMPRSS2與ERG、ETV1、ETV4基因融合成為前列腺癌早期診斷及預(yù)后判斷的手段：

TMPRSS2/ETV1融合，占比25%

TMPRSS2/ERG融合，占比55%TMPRSS2/ETV4融合，占比2%第25頁/共33頁第26頁/共33頁FISH技術(shù)在膀胱癌診斷中的應(yīng)用FISH尿液檢查A.p16缺失,是移行上皮細胞腫瘤發(fā)生的早期事件和關(guān)鍵步驟B.3,7,17染色體的不穩(wěn)定性與移行上皮細胞腫瘤的浸潤行為有關(guān)C.靈敏度(大約80%),特異性(大約96%)第27頁/共33頁p16（紅色）、17號染色體（綠色）正常細胞第28頁/共33頁p16(紅)缺失,17號染色體非整倍體第29頁/共33頁產(chǎn)品的銷售報價：

見附件1。熒光原位雜