(16)-第11章2其他類型HPLC色譜法-分子排阻

第十一章其他類型高效液相色譜法分子排阻色譜法（體積排阻色譜法、分子篩色譜法）Size-ExclusionChromatography,SEC1分析樣品：多肽、蛋白質(zhì)、 多糖等生物大分子、 高聚物2溶質(zhì)與固定相或流動相無相互作用的分離方式。一、概述3主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來進行分離的方法，即固定相（多孔凝膠）能有效的進行分子量大小的分離。4二、分離原理具有不同分子大小的樣品通過柱時，溶質(zhì)分子能夠被柱填料的孔徑分類。5二、分離原理大分子不能進入凝膠孔洞而被完全排除，只能沿著凝膠顆粒之間的空隙通過色譜柱，最先被流動相洗脫出來。6小分子能進入凝膠的絕大部分孔洞，在柱中收到更強的滯留，會更慢地被洗脫出來。7中等大小分子只能進入凝膠中一些適當(dāng)?shù)目锥粗?，但不能進入更小的微孔，所以在柱中受到的滯留作用介于大分子與小分子之間。8溶解樣品的溶劑分子，分子量最小，可進入凝膠的所有孔洞，最后從柱中流出。9VR:洗脫溶質(zhì)的保留體積；Vm:色譜柱內(nèi)凝膠顆粒之間的空間體積；Vs:凝膠內(nèi)孔體積，即溶質(zhì)分子可以滲透進去的體積洗脫體積VR＝Vm+KD·VsKD:溶質(zhì)分子能夠滲入填料內(nèi)孔體積的分?jǐn)?shù)二、分離原理10當(dāng)VR＝Vm說明溶質(zhì)完全不進入凝膠內(nèi)部，此現(xiàn)象稱為全排斥，此也為凝膠的排阻極限。溶質(zhì)分子能夠滲入填料內(nèi)孔體積的分?jǐn)?shù)KD二、分離原理KD＝011當(dāng)VR＝Vm+Vs說明溶質(zhì)完全進入凝膠內(nèi)部，此現(xiàn)象稱為全滲透，此也為凝膠的滲透極限。溶質(zhì)分子能夠滲入填料內(nèi)孔體積的分?jǐn)?shù)Kd二、分離原理KD＝112大部分溶質(zhì)：二、分離原理0<KD<1131）分離時間短，溶質(zhì)譜帶窄；2）根據(jù)分子大小，可預(yù)測分離時間；3）分離過程中無樣品損耗和反應(yīng)發(fā)生；4）柱幾乎不失活，壽命長;5）特別適用在未知樣品的探索分離優(yōu)點：14葡聚糖凝膠三、固定相聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠二乙烯基苯型凝膠多孔玻璃凝膠軟質(zhì)凝膠，不耐壓：中、低壓色譜硬質(zhì)凝膠，耐壓半硬質(zhì)凝膠15對樣品的溶解性好2.由于高分子量樣品的擴散系數(shù)小，應(yīng)盡可能采用低粘度的溶劑3.與使用的凝膠固定相互相匹配，既要使凝膠浸潤，又防止溶脹4.與所使用的檢測器相匹配四、流動相16流動相為有機溶劑：凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography，

GPC）；流動相為水：凝膠過濾色譜（gelfiltrationchromatography，GFC）17目的：用以測定分子量及分子量分布五、色譜柱的標(biāo)定方法：用一系列已知分子量的標(biāo)樣制作標(biāo)定曲線。18測定多糖的分子量與分子量分布－ChinaPharmacopoeia1)

系統(tǒng)校正：根據(jù)供試品分子量的大小，選用5個已知分子量的多糖標(biāo)準(zhǔn)品（如葡聚糖）作標(biāo)定曲線。19lgMw=a+b*tRMw：標(biāo)樣的已知重均分子量202）樣品測定取供試品溶液，進樣，根據(jù)tR帶入標(biāo)定曲線，即可求出多糖的每個組分相應(yīng)的分子量。21例1HPGPC測定雪蓮口服液中多糖的分子量色譜柱為TSK-GelG4000PWXL（7.8mm×30.0cm），預(yù)柱TSK-GelG4000PWXL（6.0mm×4.0cm）；流動相為0.7%硫酸鈉溶液（0.02%疊氮鈉）；流速為0.5ml/min；柱溫35℃；進樣量20μl。22實驗結(jié)果logM=9.077－0.2680tR，r=0.9993，保留時間代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得其分子量為37199。23例2：

Chp2005Ⅱ部p137

－頭孢曲松鈉中頭孢曲松聚合物的測定色譜柱：葡聚糖凝膠G-10(40~120μm)為填充劑流動相：pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液為流動相A；水為流動相B流速：1.5mL/min檢測波長：254nm取0.1mg/mL藍(lán)色葡聚糖2000試驗色譜系統(tǒng)適用性，n>700，拖尾因子<2.0供試品中含頭孢曲松聚合物以頭孢曲松計，不得過0.5%。24例2：頭孢曲松鈉中聚合物的檢查25色譜柱：Shodex

OHpakSB-804HQ流動相：0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)；流速：0.5mL/min檢測器：示差折光檢測器例3：古糖酯脂質(zhì)體的包封率測定26常規(guī)樣品：色譜柱：反相鍵合相色譜：中性、小極性物質(zhì)，極性物質(zhì)改變流動相：離子抑制、離子對）正相鍵合相色譜：極性很大的物質(zhì)硅膠色譜柱：分離異構(gòu)體離子交換：極性很大的物質(zhì)、生物大分子分子排阻：生物大分子

流動相：流動相組成：有機相比例，緩沖鹽種類、比例，pH

流動相洗脫方式：等度、梯度洗脫

對映異構(gòu)體：手性高效液相色譜HPLC條件的選擇27《Practical