原核生物的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控

原核生物的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控第1頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六轉(zhuǎn)錄：在DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下，以DNA鏈的一條鏈為模板，按照堿基配對原則合成RNA鏈的過程。不對稱轉(zhuǎn)錄：在DNA雙鏈分子中，轉(zhuǎn)錄通常只在DNA的一條鏈上進(jìn)行，另一條鏈則不能轉(zhuǎn)錄，但可能對轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用，這種轉(zhuǎn)錄方式稱不對稱轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄單位：就是從啟動子到終止子的一段DNA序列。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄概述第2頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六一、基因的編碼鏈和有意義鏈

模板鏈：用于轉(zhuǎn)錄RNA的鏈稱為模板鏈，或負(fù)（－）鏈，又稱無義鏈。編碼鏈：與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈稱為編碼鏈，或正（＋）鏈，又稱有義鏈。第3頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六二、轉(zhuǎn)錄的基本要點

底物：NTP；模板：反義鏈；方向：5’→3’；酶：RNA

pol；產(chǎn)物：RNA單鏈第4頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：都是遺傳信息的傳遞第5頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六三、轉(zhuǎn)錄起始位點轉(zhuǎn)錄起點位點核苷酸為＋1。上游序列upstream：轉(zhuǎn)錄起點的前面的序列，用負(fù)數(shù)碼（－）表示，起點前一個核苷酸為－1。下游序列downstream：

轉(zhuǎn)錄起點的后面的序列，用正數(shù)碼（＋）表示。沒有編號為○的堿基。第6頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六第7頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六第二節(jié)原核生物轉(zhuǎn)錄的相關(guān)酶類

一、E.coliRNA聚合酶E.coli只有一種聚合酶；E.coliRNApol全酶由5種亞基組成，即α2ββ’ωσ，480kD；α2ββ’ω構(gòu)成核心酶，核心酶與σ因子構(gòu)成全酶。

第8頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六E.coliRNA聚合酶的基本性質(zhì)第9頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六RNApolymerase

inprok.σβααβ’CoreEnzymeHoloEnzyme

forelongationforinitiation依靠靜電作用力依靠空間結(jié)構(gòu)非專一性與非特異DNA結(jié)合專一性與特異DNA結(jié)合半衰期；60’半衰期；數(shù)小時cover60bp

σβα

αβ’第10頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六RichardBurgessandAndrewTravers(1969)150kD160kD70kD40kDCartoonillustratingseparationofthesubunitsofE.coliRNApolymerasebySDS第11頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六1、核心酶：催化磷酸二酯鍵的形成α亞基：2個，功能多樣（核心酶的組建因子、促進(jìn)雙鏈的解開和重新聚合、啟動子識別、促進(jìn)RNApol與DNA模板鏈上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合）β亞基：1個，結(jié)合核苷酸底物，催化磷酸二酯鍵的形成；β’亞基：堿性強(qiáng)，與模板鏈結(jié)合；二、RNA聚合酶各亞基的功能第12頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六2、σ因子：Reusable；修飾RNApol的構(gòu)型；識別啟動子，但無催化活性。不同原核生物具有基本相同的核心酶，但σ亞基有所差別，決定了原核生物基因的選擇性表達(dá)。第13頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六3、原核生物RNA聚合酶抑制劑：利福平（Rifampin）：與細(xì)菌RNApolβ亞基結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄的起始作用；利鏈菌素（

streptolydigin）：與細(xì)菌RNApolβ亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄的延伸。肝素：與細(xì)菌RNApolβ’亞基結(jié)合，阻礙其與模板DNA的結(jié)合。第14頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六第三節(jié)原核生物轉(zhuǎn)錄的過程

RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion，elongation，termination

三過程；從promoter到terminator稱為transcriptionalunit；原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為

polycistron；轉(zhuǎn)錄起始點記為+1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值。+1

-10

+10upstreamstartpointdownstream第15頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六一、轉(zhuǎn)錄的起始

關(guān)鍵：全酶能以很高的親和性結(jié)合在啟動子promoter；啟動子：RNA聚合酶識別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。第16頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六promoter由兩個重要部分組成

（一）原核啟動子的結(jié)構(gòu)第17頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六●-70~-40：upelement（上游元件）CAP-cAMPbindingsite

●-35~-10：corepromoter（核心啟動子）

RNApol.bindingsite

基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點CAP：

CatabolitegeneActivatorProteincAMPAcceptorProtein（cAMP受體蛋白）（分解代謝基因激活蛋白）第18頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六1、核心啟動子：

SextamaBox：（Rsite）TTGAC（SextamaBox）-35site。RNApol.looselybindingsitePribnowBox：

TATAAT（pribnowBox）-10site。RNApol.firmlybindingsite（Bsite）Initiationsite：+1site。RNAtranscriptionalstartpoint（Isite）A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNA第19頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六l

SextamaBox與PribnowBox間距17bp，有利于RNApol啟動l

-35Boxor-10Boxmut.

間距趨近于17bp，upmutation間距遠(yuǎn)離于17bp，downmutation17bp的間距比17bp的序列對轉(zhuǎn)錄更為重要-35Boxand-10Boxmut.

→轉(zhuǎn)錄效率下降100倍→轉(zhuǎn)錄效率下降1000倍第20頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六2、上游元件：

CAP-cAMPbindingsite（Activatorregion，AR）當(dāng)：ARI+CAP-cAMP●ARI：CAP-cAMP的強(qiáng)結(jié)合位點（-70~-50）●

ARII：CAP-cAMP的弱結(jié)合位點（-50~-40）cooperativeeffect提高ARII的結(jié)合效率IR-70

ARI-40ARII

IR

-50第21頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六

RNApol

ARII+CAP-cAMP復(fù)合體：促使-35

box附近GC島區(qū)的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，-10

box的解鏈溫度降低，有利于轉(zhuǎn)錄啟動

ARIARIIGCIsland-35-10

●NullARII→

RNAo-10Boxbuttranscriptionoff

●

ARII+CAP-cAMPpromotionRNAo-35Boxinto-10Boxstartingtranscription

RNApol

RNApol第22頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六α-CTDCAP-cAMPARIARIIARIARIIActivationtranscription

Upelement+CAP-cAMP＋RNAPolymerase復(fù)合體

CAP-cAMP與RNAPolymerase的α-CTD結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄

第23頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六（二）原核基因轉(zhuǎn)錄的起始

1、σ因子的作用：降低全酶與一般DNA的非專一性結(jié)合力（20000倍）；增強(qiáng)全酶與啟動子Rsite、Bsite的專一性結(jié)合力（100倍）；導(dǎo)致RNA鏈的延伸緩慢第24頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六Promoter與σfactor間的結(jié)合專效性●決定了strongpromoter&weakpromoter；★-35box,-10

box的差異影響啟動子與RNApol中σ因子的結(jié)合能力；★不同啟動子的-35，-10box間存在較為保守的標(biāo)準(zhǔn)序列（標(biāo)準(zhǔn)啟動子）；★σfactorisresponsibleforrecognitionofconsensussequenceofpromoterandonlyrequiredforinitiation.第25頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六2、RNA

pol與啟動子的結(jié)合σ因子識別啟動子上結(jié)合位點。RNApol全酶與-35box結(jié)合→封閉型啟動復(fù)合物；酶向-10box移動，并與之牢固結(jié)合，促使-10box及起始位點處發(fā)生局部解鏈→開放型啟動復(fù)合物；DNA解螺旋擴(kuò)展到-10box下游17bp范圍。第26頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六3、轉(zhuǎn)錄起始位點的決定酶與-10box的結(jié)合，決定了第一個起始堿基的選擇。第一個被轉(zhuǎn)錄的堿基離-10

box的保守T約6~9nts。mRNA的起始位點多為G，其次為A

，很少為U,起始點核苷酸的兩側(cè)分別為C和T。第27頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六4、三元復(fù)合物的形成和σ因子的解離RNA合成一開始，就形成模板-RNA

pol-RNA的三元復(fù)合物。σ因子解離，核心酶與模板的親和性下降到非特異性結(jié)合的水平，RNA

pol在DNA鏈上變得容易移動，為鏈的延伸創(chuàng)造了條件；游離的σ因子可以重新進(jìn)行功能循環(huán)。第28頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六轉(zhuǎn)錄的起始核心酶在σ因子幫助下特異性結(jié)合到DNA上；RNA

pol與啟動子-35box結(jié)合，形成封閉型起始復(fù)合物；酶滑動到-10box，轉(zhuǎn)變成為開放型起始復(fù)合物，啟動子活化，雙鏈解開，模板鏈暴露，插入最初的2個核苷酸；酶繼續(xù)加上開頭的幾個NTP，形成三元起始復(fù)合物，在RNA鏈合成了8～9個堿基后，σ因子解離，轉(zhuǎn)錄開始。第29頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六ModeloftheinteractionbetweenE.coilRNApolymeraseholoenzymeandapromoterDNAIncorporatingthefirstfewNt第30頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六二、原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸

RNA

pol沿著模板鏈移動，RNA鏈不斷延伸，并保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)錄泡中的DNA螺旋前開、后合，RNA延長，不斷脫離DNA；RNA鏈的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就會減慢/停頓。第31頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六17bp螺旋解開長度12bpDNA-RNA復(fù)合體長度第32頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六影響RNA延伸速度的因素：①RNA

pol；②暫停信號：導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速度突然出現(xiàn)變化的特殊序列。GC富集區(qū)：產(chǎn)物RNA不易釋放；IR：產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，妨礙上游的模板恢復(fù)雙鏈。③其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第33頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六NusAprotein：

★69Kd,acidprotein★RNApol-attachingfactor★

ImpelRNApol.pausinginterminatorfor1’-15’andwaitingforRhofactortostoptranscriptionofRNA

★Afterinitiation→substitutingσ→NusA+coreE

antitermination

Nproteinutilizationsubstance第34頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六NusAbindstopolymerase,andNbindstobothNusAandboxBofthenutsiteregionofthetranscript,creatingaloopinthegrowingRNA.Thiscomplexisrelativelyweakandcancauseantiterminationonlyatterminatorsnearthenutsite(Theseconditionsexistonlyinvitro.).(NutNbindingsite

)antiterminationNprotein第35頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六三、原核生物轉(zhuǎn)錄的終止

轉(zhuǎn)錄的終止依賴于RNA產(chǎn)物的特定序列；原核和某些真核生物的終止子要求轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA3’端具有發(fā)夾的二級結(jié)構(gòu)，莖部富有GC序列；終止子的分類：根據(jù)終止反應(yīng)是否需要ρ蛋白第36頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六1、不依賴于ρ因子的終止子（強(qiáng)終止子）結(jié)構(gòu)特點：RNA具有一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)（富含GC）和隨后polyU片段。作用機(jī)制：RNApol+發(fā)夾結(jié)構(gòu)→轉(zhuǎn)錄暫?！箅S雜合分子不穩(wěn)定的poly(U-dA)→RNA容易從模板上脫落→RNA-DNA-RNApol解聚→轉(zhuǎn)錄終止第37頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六第38頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六2、依賴于ρ因子的終止子（弱終止子）

ρ因子：55kD，六聚體。能夠利用水解ATP釋放的能量使RNA從三元復(fù)合物中釋放出來；結(jié)構(gòu)：仍然具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但GC堿基對含量較少，下游也缺乏polyU結(jié)構(gòu)。

第39頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六第40頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六1、2、3、第41頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六終止類型回文序列后隨序列不依賴ρ因子的終止子富含GC富含U依賴ρ因子的終止子不富含GC不富含U第42頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六第四節(jié)原核生物轉(zhuǎn)錄的調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì)、靈活，又是最為重要、復(fù)雜的調(diào)控；①確定需要轉(zhuǎn)錄基因的起始位點；②精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平；③cisfactor與transfactor嚴(yán)格又靈活的互作；④保證RNApol的連續(xù)轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確終止。第43頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六一、原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)概念

（一）誘導(dǎo)和阻遏：誘導(dǎo)：酶的合成取決于特定物質(zhì)（常為substrate）的存在。如培養(yǎng)基中乳糖的存在促進(jìn)了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：當(dāng)培養(yǎng)基中某種物質(zhì)（常為product）含量較高，細(xì)胞就關(guān)閉合成這種物質(zhì)的能力。如培養(yǎng)基中Trp的存在抑制了E.coli

Trp的合成；第44頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六（二）調(diào)控的效應(yīng)物調(diào)節(jié)蛋白+小分子物質(zhì)→原核操縱子的誘導(dǎo)/阻遏。這些小分子是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物質(zhì)--效應(yīng)物。誘導(dǎo)物（inducer）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，使其從DNA分子上脫落下來，RNApol開始轉(zhuǎn)錄。輔阻遏物（co-repressor）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，可以提高調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因的親和性，進(jìn)而關(guān)閉結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。第45頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六（三）正調(diào)控和負(fù)調(diào)控

正調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。負(fù)調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后抑制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。正、負(fù)調(diào)控都存在著誘導(dǎo)和阻遏。第46頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六positiveactiveinactiveInd.Rep.①正調(diào)控+誘導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白無活性→轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行誘導(dǎo)物+調(diào)節(jié)蛋白→有活性調(diào)節(jié)蛋白→轉(zhuǎn)錄進(jìn)行②正調(diào)控

+阻遏調(diào)節(jié)蛋白有活性→轉(zhuǎn)錄進(jìn)行輔阻遏物+調(diào)節(jié)蛋白→無活性調(diào)節(jié)蛋白→轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行第47頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六negativeactiveinactive阻遏蛋白有活性→轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行誘導(dǎo)物+阻遏蛋白→無活性阻遏蛋白→轉(zhuǎn)錄進(jìn)行③負(fù)調(diào)控

+誘導(dǎo)④負(fù)調(diào)控+阻遏阻遏蛋白無活性→轉(zhuǎn)錄進(jìn)行輔阻遏物+阻遏蛋白→有活性調(diào)節(jié)蛋白→轉(zhuǎn)錄不進(jìn)行Ind.Rep.Negative第48頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六二、操縱子理論（operonconcept）定義：原核生物基因表達(dá)和調(diào)控的單元。包括：①結(jié)構(gòu)基因：編碼控制某一代謝途徑的相關(guān)的酶；②調(diào)控元件：是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，包括啟動子和操縱基因；③調(diào)節(jié)基因：其產(chǎn)物（調(diào)節(jié)蛋白）能夠識別并結(jié)合操縱基因，決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否。第49頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六（一）lac操縱子（lactoseoperon）：1、lac操縱子的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因（I）：編碼阻遏物（Repressor）。啟動子（Promoter，P）：RNA

pol的結(jié)合位點；操縱基因（Operator，O）：進(jìn)入結(jié)構(gòu)基因的開關(guān)；結(jié)構(gòu)基因：Z（β-半乳糖苷酶）、Y（β-半乳糖苷透過酶）、A（β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶）；第50頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六β-半乳糖苷酶：水解含β-半乳糖苷鍵的底物，如乳糖。β-半乳糖苷透過酶：使外界的β-半乳糖苷能透過E.coli細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶：乙酰CoA+β-半乳糖苷→乙酰半乳糖。當(dāng)E.coli需要利用培養(yǎng)基里的乳糖時，前2種酶是必需的，而最后1種酶則是非必需的。第51頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六

沒有乳糖→lacI編碼的阻遏蛋白具有活性→牢固結(jié)合到操縱基因O上→結(jié)合在啟動區(qū)的RNApol不能通過→Z、Y、A不能轉(zhuǎn)錄（和表達(dá)）2、lac操縱子的負(fù)向調(diào)控機(jī)制負(fù)調(diào)控+誘導(dǎo)第52頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六

加入乳糖→乳糖（誘導(dǎo)物）與阻遏蛋白結(jié)合→阻遏蛋白構(gòu)象變化→阻遏蛋白從操縱基因上脫落→RNApol開始Z、Y、A基因的轉(zhuǎn)錄→表達(dá)→乳糖被利用第53頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六3、lac操縱子CAP的轉(zhuǎn)錄激活作用正調(diào)控CAP：二聚體，可同時與DNA、cAMP結(jié)合；G存在→細(xì)胞內(nèi)[cAMP]↓→CAP二聚體不能單獨與DNA結(jié)合→lac操縱子關(guān)閉G缺乏→細(xì)胞內(nèi)[cAMP]↑→CAP與cAMP結(jié)合→CAP-cAMP復(fù)合物+lac操縱子啟動子上游

→DNA鏈發(fā)生90o彎曲→增強(qiáng)RNApol與啟動子的結(jié)合→lac操縱子打開→Z、Y、A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)第54頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六CAP第55頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六乳糖操縱子的協(xié)同調(diào)節(jié)(coordinateregulation)負(fù)向調(diào)節(jié)與正性向調(diào)節(jié)協(xié)同合作阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP不發(fā)揮作用如沒有CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，即使阻遏蛋白從lacO上s釋放仍無轉(zhuǎn)錄活性結(jié)論：lac操縱子強(qiáng)的誘導(dǎo)作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖第56頁，共67頁，2023年，2月20日，星期六（二）trp操縱子Trp的合成：一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果（分支酸→鄰氨基苯甲酸→吲哚甘油磷酸→Trp）；1、trp操縱子的阻遏系統(tǒng)－轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)有Trp：Trp結(jié)合并激活阻遏蛋白，阻斷轉(zhuǎn)錄；無Trp：阻遏蛋白無活性，操縱子基因開始轉(zhuǎn)錄。第57頁，共67頁，202