高效液相色譜法續(xù)

高效液相色譜法續(xù)第1頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

例如鄰位、間位和對(duì)位羥基苯甲酸的Ka1（25℃）分別為1.05×10-3(o-HBA)、8.3×10-5(m-HBA)和2.6×10-5(p-HBA)。它們?cè)谒胁糠蛛x解，溶液呈弱酸性:

-BondapakC18(4mm×300mm,10m)Ⅰ35%CH3OH+65%H2OⅡ35%CH3OH+0.03%CF3CO2H(pH2.5)

鄰位、間位和對(duì)位羥基苯甲酸色譜分析問(wèn)題：1）硅膠柱能否分離？

2）ODS怎樣分離？第2頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、離子抑制技術(shù)

RCOOHRCOO－＋H＋

如果R基團(tuán)具有一定的疏水性，當(dāng)降低流動(dòng)相的酸度,離解增大,造成保留降低；增大流動(dòng)相酸度,抑制RCOOH離解,保留時(shí)間增大。離子抑制色譜正是調(diào)節(jié)流動(dòng)相合適的pH值,使弱酸或弱堿的有機(jī)物得到滿意的分離。

通常，分離弱酸：pH≤pKa

–2;而分離弱堿：pH≥pK+2。但實(shí)際上,硅基柱離子抑制色譜通常只用于pKa≥3的弱酸的分離（為什么？），弱堿的分離只能采用聚合物柱。第3頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

未保留溶劑峰

o-m-p-酸抑制：o-m-p-第4頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二五、離子對(duì)色譜

RSO3－＋A＋

RSO3A(RSO3A)SPtR=to(1＋1/×KIP[Cm-]（1）離子對(duì)試劑陽(yáng)離子樣品-己基磺酸鈉；陰離子樣品-四丁基胺鹽。（2）流動(dòng)相優(yōu)化流動(dòng)相系統(tǒng)最好是CH3OH/H2O，緩沖液一般是磷酸鹽（pH1.8~3.5和5.8~8.0）和醋酸鹽（pH3.7~5.6）。最好保持柱溫穩(wěn)定。用于分離酸的色譜柱最好與分離堿的色譜柱分開(kāi)。實(shí)驗(yàn)后要及時(shí)清洗：先6-7倍柱體積水（為什么？），再用5%CH3OH/H2O洗至中性。第5頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖IP-HPLC中溶劑優(yōu)化設(shè)計(jì)A(CH3OH)B(pH=2.5)C(pH=7.5)D(己烷磺酸鹽)陽(yáng)離子樣品分析第6頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4．應(yīng)用舉例（1）酸和堿混合物的分離（2）金屬螯合物的分離第7頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水基團(tuán)分布示意圖CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3CH3外部親水內(nèi)疏水核

蛋白質(zhì)分子具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜體系，外部有一親水層，內(nèi)部有疏水核。蛋白質(zhì)表面親水性很強(qiáng)，但也存在一些非極性的疏水基團(tuán)（苯環(huán)等）或疏水區(qū)域。生物大分子色譜第8頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二鹽析的原因：鹽離子與蛋白質(zhì)表面具有相反電性的基團(tuán)形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電中性，使蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用減弱而聚集起來(lái)；由于中性鹽的親水力比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。

生物樣品中蛋白質(zhì)的除去可采用硫酸銨沉淀法。

蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會(huì)隨鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出（鹽析）。CO2-NH4+NH3+NH3+NH3+SO42+NH4+SO42+蛋白質(zhì)鹽析機(jī)理示意圖

第9頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二六、疏水作用色譜

疏水相互作用色譜法（HIC）指采用適度疏水性的固定相,以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相分離生物大分子（如蛋白質(zhì)）鍵合相色譜方法。

其特點(diǎn)是：采用中性或接近中性的鹽水溶液洗脫,樣品的生物活性高,成本低等。疏水色譜中無(wú)機(jī)鹽的作用與鹽析沉淀蛋白質(zhì)的作用十分相似。第10頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

在HIC中,通常使用大孔徑(~100nm)聚合物凝膠上鍵合一層低密度苯基官能團(tuán)的有機(jī)物為柱填料(如5PW-HIC)的色譜柱,而使用的洗脫劑一般是中性鹽緩沖液,

洗脫方式采用降低鹽濃度的梯度方式。

HIC分離原理:是基于欲分離的物質(zhì)表面憎水性殘基與固定相表面苯基之間的相互作用。在高離子強(qiáng)度的緩沖液中,這些含大量憎水殘基的生物物質(zhì)很容易與固定相表面的苯基產(chǎn)生非極性相互作用。通過(guò)梯度洗脫技術(shù)降低洗脫劑的離子強(qiáng)度可減弱這些物質(zhì)與固定相之間的相互作用,將組分一一分離。第11頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖蛋白質(zhì)在疏水柱和反相柱上的分離比較1細(xì)胞色素C2肌紅蛋白3溶菌酶TSK5PW硫酸銨從1.7減少到0.1mol/LRP-304乙腈從0增加到100%第12頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二疏水作用色譜與反相色譜的比較★（固定相的差別）HIC填料表面疏水性沒(méi)有RPC強(qiáng)：疏水基團(tuán)一般是低密度的苯基、戊基、丁基、丙基等★（流動(dòng)相的差別）

HIC一般采用pH6-8的鹽水溶液[如(NH4)2SO4]，作降濃度洗脫。在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時(shí)，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來(lái)★（應(yīng)用特點(diǎn)）HIC分離條件有利于蛋白質(zhì)保持活性，回收率高第13頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二離子性化合物如何分離？●光度檢測(cè)的可行性

鹵素、無(wú)機(jī)酸根和一些弱的有機(jī)酸根離子，在可見(jiàn)或紫外區(qū)域沒(méi)有光吸收或吸收很弱。所以用一般的紫外、可見(jiàn)及示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，很難獲得滿意的結(jié)果?！褚种苹螂x子對(duì)色譜●離子交換色譜(IEC)離子化合物如何檢測(cè)？●電導(dǎo)檢測(cè)的可行性：

電導(dǎo)是離子的通用性質(zhì)，但洗脫液的電導(dǎo)如何消除？第14頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

通常離子交換色譜采用較高濃度的酸/堿/鹽為淋洗液，淋洗液本身具有較高的電導(dǎo)（淋洗液的電導(dǎo)，通常稱為“本底電導(dǎo)”或“基體電導(dǎo)”）。待測(cè)離子的電導(dǎo)變化往往會(huì)被淋洗液的本底電導(dǎo)所掩蓋（為什么？），難以采用電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。第15頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二11.7離子色譜(IonChromatography)

離子交換色譜（IEC）是最先得到應(yīng)用的液相色譜分析方法。目前，離子交換色譜不如其它HPLC模式應(yīng)用廣泛，許多離子混合物分析應(yīng)用被離子對(duì)色譜和離子色譜所代替。

氨基酸的分離：采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，不同的酸度和離子強(qiáng)度分段洗脫。①氨基酸分析儀②柱后衍生檢測(cè)（如茚三酮）●糖類的分離：糖化合物與硼酸生成絡(luò)陰離子,用陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離。第16頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第17頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

離子色譜的由來(lái)：早期的IEC，缺少相匹配的檢測(cè)器，難于發(fā)揮更大的作用。如無(wú)機(jī)離子與大多數(shù)有機(jī)離子不同，只有在遠(yuǎn)紫外區(qū)才有吸收，光度檢測(cè)器不適合于檢測(cè)無(wú)機(jī)離子；但在IEC中,通常采用強(qiáng)電解質(zhì)作洗脫液,流動(dòng)相的本底電導(dǎo)淹沒(méi)了樣品離子的電導(dǎo),使得人們無(wú)法采用通用的電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

離子色譜是一種分析離子化合物的液相色譜,它是在離子交換色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。1975年Small發(fā)明了采用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)離子交換色譜流出液的方法。為有別于以往的離子交換色譜法，他把這一方法稱為“離子色譜”。第18頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二為什么需要抑制背景電導(dǎo)？X-/NaHCO3-Na2CO3

500t/minFCl5001放大檢測(cè)信號(hào)，背景信號(hào)同時(shí)增大，并不能改善檢測(cè)限分離柱抑制柱第19頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、離子色譜法的基本原理淋洗液槽泵進(jìn)樣閥分離柱

電導(dǎo)檢測(cè)

抑制柱

記錄儀輸送分離檢測(cè)數(shù)據(jù)處理圖離子色譜儀流程圖圖淋洗液抑制反應(yīng)對(duì)離子檢測(cè)的影響離子交換柱第20頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二●分離過(guò)程：當(dāng)淋洗液將樣品離子X(jué)-帶到陰離子交換分離柱時(shí)，由于各種離子對(duì)離子交換樹(shù)脂的親合力不同，樣品在分離柱上分離成不連續(xù)的譜帶，并依次被淋洗液洗脫下來(lái)并與淋洗液一起流出分離柱。交換：R+-OH-+Na+X-→R+-X-+Na+OH-洗脫：R+-X-+Na+OH-→R+-OH-+Na+X-

離子色譜基本原理高效離子交換色譜分離電導(dǎo)抑制器（最常見(jiàn)檢測(cè)方式）1）分析柱的選擇？2）出峰順序？如鹵素陰離子？3）如何獲得高柱效？思考題：第21頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二●抑制過(guò)程：當(dāng)分離后的樣品離子與淋洗液一起進(jìn)入抑制柱時(shí)，由于抑制柱中填充有陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，淋洗液與分析樣品就發(fā)生了如下的反應(yīng)：

Na+OH-+R--H+→R--Na++H2ONa+X-+R--H+→R--Na++H+X-

由此可見(jiàn)淋洗液中Na+置換出H+，把OH-中和成水，消除了原來(lái)淋洗液的高電導(dǎo)，有利于電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)待測(cè)離子與氫離子形成強(qiáng)酸離子對(duì)，在陽(yáng)離子中由于氫離子的極限摩爾電導(dǎo)最大，這樣就有利于陰離子的分析。注意：電導(dǎo)檢測(cè)器是一種通用性檢測(cè)器，它檢測(cè)的溶液中陰離子和陽(yáng)離子的電導(dǎo)總和。第22頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二思考題：1）抑制柱的選擇？2）如何獲得大容量抑制柱？3）試分析NaHCO3-Na2CO3洗脫液的抑制過(guò)程。

離子色譜→電導(dǎo)檢測(cè)→抑制原理離子色譜法解決了陰離子型化合物長(zhǎng)期以來(lái)缺乏快速靈敏分析方法問(wèn)題。目前它是陰離子分離分析的首選方法（無(wú)機(jī)陰離子分析的“ICP”方法）。從無(wú)機(jī)和有機(jī)陰離子到金屬陽(yáng)離子，從有機(jī)陽(yáng)離子到糖類、氨基酸等均可用離子色譜法進(jìn)行分析。環(huán)境分析水質(zhì)分析

第23頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二AB圖用填充樹(shù)脂抑制柱時(shí)電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)的變化

1.F-

，2.Cl-

，3.NO2-

，4.H2PO32-

，5.Br-

，6.NO3-

，7.SO42-用新再生的填充樹(shù)脂抑制柱時(shí)獲得的色譜圖用耗用了一半的填充樹(shù)脂抑制柱時(shí)獲得的色譜圖(A)(B)第24頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、離子色譜抑制器化學(xué)抑制

抑制器是離子色譜儀電導(dǎo)檢測(cè)的一個(gè)核心部件，抑制能力和使用的方便性是其主要性能指標(biāo)?！駱?shù)脂填充式抑制柱●纖維管抑制柱●平板微膜抑制柱●電化學(xué)抑制器（重點(diǎn)）

抑制容量：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)抑制柱可抑制的淋洗離子的摩爾數(shù)。第25頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1）樹(shù)脂填充式抑制柱陰離子分析：分離柱采用低容量強(qiáng)堿型陰離子交換柱,常用NaHCO3和Na2CO3混合液作流動(dòng)相；串聯(lián)在分析柱后面的抑制柱則采用高容量的強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱。

樹(shù)脂填充式抑制柱缺點(diǎn)：

A.抑制柱需定期再生。（如何再生？）

B.弱酸陰離子和弱堿陽(yáng)離子在抑制柱中的行為復(fù)雜。陽(yáng)離子分析：分離柱為低交換容量強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂,而抑制柱是交換容量大的強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂,洗脫液中高電導(dǎo)的H＋被抑制柱反應(yīng)生成低電導(dǎo)的水,最后檢測(cè)的是流出液中的M＋和OH－的電導(dǎo)。

第26頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2）纖維管抑制柱

采用磺化的聚乙烯陽(yáng)離子交換空心纖維管為抑制柱。在纖維管外表面通過(guò)與淋洗液（NaHCO3）逆向而行的再生液（H2SO4）。當(dāng)淋洗液（NaHCO3）通過(guò)纖維管時(shí)，陽(yáng)離子Na+被庫(kù)侖力吸引到管壁的離子—SO3-基上，同時(shí)再生液（H2SO4）中的質(zhì)子也被吸引，并通過(guò)下述反應(yīng)不斷消耗H+，使H+透過(guò)膜的擴(kuò)散不斷進(jìn)行以下反應(yīng)：CO32-+H+→H2CO3優(yōu)點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)抑制柱的在線再生，克服了填充式定期再生的問(wèn)題。缺點(diǎn)：離子交換速度慢；纖維管的加工工藝復(fù)雜，管內(nèi)有時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡，干擾測(cè)量，還需推動(dòng)再生液的裝置；受淋洗液強(qiáng)度限制，不能進(jìn)行梯度洗脫。

第27頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖纖維管抑制柱CO32-+H+→H2CO3H2SO4NaHCO3+X-H+Na+陽(yáng)離子交換膜第28頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3）平板微膜抑制柱85年,Dionex公司★在流出液通道填充細(xì)目交換劑，提高了離子交換速度，從而提高了抑制柱的交換容量★抑制柱的死體積小檢測(cè)器分離柱第29頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4）電化學(xué)抑制器85年，田昭武、胡榮宗等研制成功XYZ-1型電化學(xué)抑制柱。92年，Dionex公司推出SRS系列電化學(xué)抑制柱。第30頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二海水淡化----電滲析原理+-鹽水淡水極水1離子在電場(chǎng)下的定向遷移2膜的選擇性透過(guò)3分離對(duì)象/產(chǎn)品的去向關(guān)注第31頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)抑制器的工作原理圖電化學(xué)膜抑制器的抑制原理(陰離子分析)

對(duì)比電滲析●膜類型及位置●離子的遷移●作用及目的思考題：試設(shè)計(jì)用于陽(yáng)離子分析的電化學(xué)抑制器。第32頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)抑制器陽(yáng)極室的H+穿過(guò)陽(yáng)離子膜進(jìn)入中間的抑制室：

HCO3-+H+→H2CO3流出液中Na+的穿過(guò)陽(yáng)離子膜進(jìn)入陰極室流出液中的樣品離子Cl-的電遷移受到陽(yáng)離子膜的阻斷Cl-/NaHCO3Cl-/H++H2CO3+-H+

Na+

Cl-

H2SO4

第33頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二+-鹽水淡水+-Cl-/NaHCO3Cl-/H++H2CO3抑制器與電滲析對(duì)比原理相同目的不同陽(yáng)極室膜的種類不同第34頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)抑制的特點(diǎn)●與化學(xué)抑制柱不同，電化學(xué)抑制器是以電場(chǎng)力作為離子遷移的動(dòng)力，提高了抑制速度，從而提高了抑制柱的抑制容量和縮短了抑制時(shí)的平衡時(shí)間?！袷闺妼?dǎo)檢測(cè)的梯度淋洗成為了可能。第35頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖電再生固相抑制柱(ERIS)的抑制和再生示意圖圖離子逆流原理

近幾年來(lái)，Alltech公司提出了一種電再生固相抑制柱(ERIS)以實(shí)現(xiàn)再生液的自再生和抑制柱的連續(xù)工作；Small提出了“離子逆流”原理，在一根抑制柱上實(shí)現(xiàn)了將淋洗液的產(chǎn)生、陰離子的分離和淋洗液的抑制都集中在一根抑制柱中自動(dòng)完成。（結(jié)合查考文獻(xiàn)自學(xué)?。┑?6頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、非抑制離子色譜“單柱法”

單柱離子色譜法的基本原理是以低容量的離子交換色譜柱分離，采用低電導(dǎo)低濃度的洗脫液，由于降低了洗出液本底電導(dǎo)水平，這樣可采用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)樣品離子的電導(dǎo)。單柱法通?？稍谄胀ㄉV儀上進(jìn)行。陰離子分析可用低濃度（1×10-4-1×10-5mol/L）的苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽作為洗脫劑；陽(yáng)離子分析則采用1-2mol/L的HNO3或乙二胺鹽作為洗脫劑。第37頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

在使用上，雙柱法具有較高的靈敏度，但死體積較大；而單柱法死體積較小，比雙柱法使用更低濃度的洗脫劑以及更低交換容量的填料，但由于其柱容量小，因此，進(jìn)樣量受到一定的限制。

單柱法的檢測(cè)：電導(dǎo)法和間接光度法

間接光度法是一種離子對(duì)探針檢測(cè)無(wú)紫外響應(yīng)物質(zhì)的技術(shù)。在離子色譜中，如果流動(dòng)相含有吸收紫外光性能的洗脫離子，那么可以采用紫外檢測(cè)器間接檢測(cè)無(wú)紫外吸收的樣品離子。第38頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、間接光度色譜法

(Indirectphotometricchromatography)方法原理：在陰離子分離中，假設(shè)以具有吸收紫外光性能的洗脫掖Na+E-溶液來(lái)洗脫無(wú)吸收的樣品液Na+S-

，可以通過(guò)檢測(cè)E-的變化來(lái)間接測(cè)定S-。因?yàn)榛诮粨Q平衡原理和電中性原理，在流出液中，當(dāng)S-離子出現(xiàn)時(shí)，洗脫劑中的E-離子必然有一協(xié)調(diào)的、等當(dāng)量的改變（Na+的濃度確定，S-增大，E-則減少），這樣連續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫離子E-的濃度變化，從而反應(yīng)出S-離子在柱中被分離的情況。間接光度法出現(xiàn)負(fù)峰色譜圖，可將信號(hào)轉(zhuǎn)化為“正峰”處理。第39頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

可見(jiàn)在間接光度色譜法中，洗脫劑的吸收光離子具有雙重作用：

l

從色譜分離柱中選擇性地洗脫樣品離子

l

在流出液中充當(dāng)樣品離子的探針

此外，對(duì)于無(wú)吸收的樣品離子間接光度法的色譜峰面積只與樣品離子的濃度有關(guān)，而與樣品的種類無(wú)關(guān)，同時(shí)靈敏度隨所用洗脫劑的濃度的降低而增大。

除了傳統(tǒng)的以抑制柱為特點(diǎn)的離子交換色譜（HPIC）外，離子色譜技術(shù)還出現(xiàn)了以Donnan排斥、空間排阻和吸附過(guò)程為分離機(jī)理的離子排斥色譜（HPIEC）和以吸附為分離機(jī)理的離子對(duì)色譜（MPIC）。第40頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二五、離子排斥色譜

(IonExclusionChromatography，IEC)

高容量陽(yáng)離子交換樹(shù)脂使樣品陰離子由于受到Donnan排斥很快流出色譜柱,而低電離度弱酸分子能進(jìn)入到樹(shù)脂內(nèi)部，且通過(guò)溶質(zhì)與樹(shù)脂功能團(tuán)之間的極性相互作用和溶質(zhì)與樹(shù)脂基體間的非極性相互作用為固定相保留。因此，在離子排斥色譜中溶質(zhì)的保留作用取決于：

l

溶質(zhì)受阻程度的不同

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溶質(zhì)與樹(shù)脂功能團(tuán)間極性相互作用的差別

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溶質(zhì)與樹(shù)脂功能團(tuán)間非極性相互作用的差別第41頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

離子排斥色譜主要用于有機(jī)酸無(wú)機(jī)弱酸和醇類的分離。如用離子排斥色譜柱,稀鹽酸為流動(dòng)相,可分析30余種常見(jiàn)的水可溶性有機(jī)酸,其中包括用氣相色譜難于分析的羥基有機(jī)酸。

強(qiáng)酸中弱有機(jī)酸的測(cè)定，用陰離子交換分離是非常困難的。例如2.5g/L硫酸中1.0mg/L脂肪酸等弱酸（為什么？）。

但用IEC，硫酸根不被保留，不干擾弱酸（檸檬酸、羥基丁二酸、乙醇酸、乙酸、丁二酸）的定量。第42頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二11.8體積排阻色譜

(SizeExclusionChromatography,SEC)

體積排阻色譜,也稱為凝膠色譜,包括:?凝膠過(guò)濾色譜(GFC):,以水為流動(dòng)相?凝膠滲透色譜(GPC):以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。

在許多色譜模式探索中,人們往往從溶質(zhì)——固定相——流動(dòng)相之間的相互作用力來(lái)討論色譜分離問(wèn)題。流動(dòng)相溶劑的選擇非常重要。

對(duì)于排阻色譜，這一思路是否可行？第43頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二排阻色譜分離機(jī)理:(注意與其它液相色譜的不同點(diǎn)）一般液相色譜是根據(jù)樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間的平衡分配系數(shù)不同，造成不同的移動(dòng)速度而達(dá)到分離。而排阻色譜是根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸(分子量、有效體積、流體力學(xué)體積)的差別進(jìn)行分離的。它主要應(yīng)用于高分子化合物和聚合物的分子量分布測(cè)定,在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。第44頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1．排阻色譜分離過(guò)程

排阻色譜的分離過(guò)程是在裝有多孔物質(zhì)(交聯(lián)聚苯乙烯、多孔玻璃、多孔硅膠等)為填料的柱中進(jìn)行的,填料的孔徑在制備時(shí)已嚴(yán)格加以控制。.溶質(zhì)在填料中的滲透體積不同樣品分子通過(guò)多孔填料的排阻機(jī)理示意圖第45頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

如果某樣品分子太大不能進(jìn)入填料的孔中,就會(huì)被填料所排阻。這些大的樣品分子直接流過(guò)柱子,并首先在色譜圖上出現(xiàn)。一些小到幾乎可滲透到整個(gè)填料顆粒的樣品分子具有最大保留值,通過(guò)柱子最慢,并最后在色譜圖上出現(xiàn)。而中等體積的樣品分子靠近孔壁的可能較小,平均來(lái)說(shuō),這些分子在孔中停留的時(shí)間較短,它們通過(guò)柱子的速度取決于它們的相對(duì)大小。色譜柱體積：

Vc=VM+VS+V式中V為填料體積，VS為填料微孔隙總體積,VM為柱空隙體積（顆粒間隙體積）。第46頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二組分的洗脫體積：

Ve=VM＋KdVS

式中Kd為排阻色譜的分配系數(shù),它表示組分分子可以擴(kuò)散進(jìn)入的內(nèi)孔體積(即對(duì)某種尺寸的溶質(zhì)分子來(lái)說(shuō)可以滲透進(jìn)去的那部分孔體積)與內(nèi)孔總體積之比。

排阻色譜中樣品分子的大小是指它在流動(dòng)相中的有效體積,即它在流動(dòng)相中的轉(zhuǎn)動(dòng)半徑,這與分子的幾何形態(tài)(球形、棒形或無(wú)規(guī)則卷曲形)和溶劑化作用有關(guān)。第47頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二?Kd=0,Ve=VM

樣品分子被完全排阻；?Kd=1,Ve=VM＋VS

樣品分子完全滲透（自由擴(kuò)散）；?0<Kd<1,VM<Ve<VM＋VS

樣品分子選擇性滲透,樣品組分按它們的分子大小被分離。出峰順序?yàn)閺拇蟮叫?均在溶劑峰之前流出柱子。思考：1）排阻色譜的出峰順序？

2）洗脫溶劑對(duì)分離是否有影響？

在排阻色譜中，選擇性僅與分子大小的差異有關(guān)。要改進(jìn)分離度只能靠凝膠的孔徑大小和孔徑分布的最佳化來(lái)實(shí)現(xiàn)。由懸浮聚合產(chǎn)生的均勻球型微粒能提供高的柱效率。與其它色譜的最大的區(qū)別為洗脫出的組分峰寬相等。第48頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第49頁(yè)，共57頁(yè)，2023年，2月20日，星期二排阻色譜(SEC)—色譜柱校正曲線Eluent:THF