酶和細(xì)胞固定化詳解演示文稿

酶和細(xì)胞固定化詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三優(yōu)選酶和細(xì)胞固定化現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三1、固定化酶的定義2、酶的固定化方法3、固定化酶的特點(diǎn)GoGoGo4、固定化酶的評(píng)價(jià)Go現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三7.1固定化酶的定義水溶性酶水不溶性載體固相酶（水不溶性酶）固定化技術(shù)現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三

固定化酶(enzymeimmobilization):是指固定在一定的載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。形式：酶柱—連續(xù)生產(chǎn)反應(yīng)器—批式攪拌反應(yīng)酶膜、酶管—分析化學(xué)微膠囊酶—治療酶

現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三幾點(diǎn)要求:

（酶的固定化）

保持酶的催化活性和專(zhuān)一性固定化酶可回收及多次使用酶固定化后產(chǎn)生的位阻要小固定化酶的成本盡可能低，以利用于工業(yè)化生產(chǎn)使用現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三7.2酶固定化方法現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三通過(guò)氫鍵、疏水作用、離子鍵等物理作用，將酶或含酶菌體吸附在水不溶載體表面的方法。是酶固定化最簡(jiǎn)單的方法

1、吸附法(absorptionmethod)現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三（1）物理吸附法酶與載體之間的親和力：范德華力、氫鍵、疏水作用常用的載體：有機(jī)載體和無(wú)機(jī)載體

有機(jī)載體：纖維素、淀粉、骨膠原、火棉膠無(wú)機(jī)載體：氧化鋁、硅藻土、微孔玻璃無(wú)機(jī)載體吸附容量低，一般在每克載體吸附1mg蛋白。有機(jī)載體吸附容量高一些，火棉膠吸附木瓜蛋白，吸附容量每平方厘米膜70mg蛋白。現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三特點(diǎn)：載體來(lái)源廣泛、操作簡(jiǎn)單、對(duì)酶的活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)影響少

。由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三（2）離子吸附法酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶載體的固定方法。常用的載體

陰離子交換劑：二乙基氨基乙基（DEAE）—纖維素、

DEAE—葡聚糖凝膠陽(yáng)離子交換劑：CM-纖維素、纖維素檸檬酸鹽離子吸附容量一般大于物理吸附容量，50-150mg蛋白/g載體現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法多孔載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、明膠

2、包埋法(entrapmentmethod)現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，酶分子僅僅被包裹，未受到化學(xué)反應(yīng)，酶活力回收力高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物的酶，不適合作用于大分子底物的酶根據(jù)載體材料和方法不同分為：凝膠包埋法半透膜包埋法現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三將酶或含酶菌體包埋交聯(lián)的水不溶凝膠格子的包埋方法。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹(shù)脂等合成凝膠。

1）凝膠包埋法現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三海藻酸鈣凝膠包埋法將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。操作簡(jiǎn)單、條件溫和，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三●將酶包埋于具有半透性聚合物膜內(nèi)的固定化方法。

半透膜的孔徑小于酶分子的直徑，可以防止酶與膜外環(huán)境直接接觸，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性?！癯Ｓ糜谥苽涔潭ɑ傅陌胪改び芯埘０纺ぁ⒒鹈弈z膜等。

2）半透膜包埋法現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三酶分子與載體之間以共價(jià)鍵作用而實(shí)現(xiàn)結(jié)合的固定方法稱(chēng)為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。3、共價(jià)結(jié)合法(combinemethod)現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三載體的要求選擇親水性載體載體結(jié)構(gòu)松散、表面積大、一定的機(jī)械強(qiáng)度載體要有在溫和條件下與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)載體沒(méi)有或少有非專(zhuān)一性吸附載體來(lái)源容易、可反復(fù)使用現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三載體的選擇

載體結(jié)構(gòu)疏松、表面積大、機(jī)械強(qiáng)度載體有與酶共價(jià)的功能基團(tuán)載體吸附功能有一定的專(zhuān)一性載體來(lái)源廣、價(jià)格廉價(jià)、重復(fù)使用現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三酶蛋白上可供載體結(jié)合的基團(tuán)酶蛋白N端氨基或賴(lài)氨酸的ε-氨基酶蛋白C端的羧基以及天冬氨酸和谷氨酸的r-羧基半胱氨酸的巰基絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸-羥基組氨酸-咪唑基苯丙氨酸、酪氨酸—苯環(huán)色氨酸的吲跺基r現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三酶分子可以形成的共價(jià)鍵基團(tuán)氨基、羧基、巰基、咪唑基常用的載體活化與偶聯(lián)反應(yīng)：重氮反應(yīng)、疊氮反應(yīng)、溴化氮法、烷化法現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三借助雙功能試劑在酶分子之間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間發(fā)生交聯(lián)作用，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。4、交聯(lián)法(crosslinkingmethod)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三常用的雙功能試劑戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐其中常用的是戊二醛交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三共價(jià)交聯(lián)法的四種形式：（1）酶直接交聯(lián)法（2）酶輔助蛋白交聯(lián)（4）載體交聯(lián)法（3）吸附交聯(lián)法現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。

固定化依賴(lài)于酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。操作簡(jiǎn)單，但是缺乏選擇性，固定化的重現(xiàn)性較差，活力回收往往不高。（1）酶直接交聯(lián)法：現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三舉例：酶直接交聯(lián)法—固定化酶木瓜蛋白酶0.2℅酶蛋白濃度、2.3℅戊二醛、pH5.2~7.2、0℃交聯(lián)24小時(shí)，可形成固定化酶。隨pH升高，固定化速度增加pH低于4不能形成固定化酶有人認(rèn)為pH控制在酶的等電點(diǎn)附近有利于固定化現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三

酶分子在雙功能試劑或多功能試劑的作用下，與一些惰性蛋白或水不溶的載體之間發(fā)生交聯(lián)的酶固定法。當(dāng)可得到的酶量有限，可以使用第二個(gè)“載體”蛋白來(lái)增加蛋白質(zhì)濃度，可使酶與惰性蛋白共交聯(lián)。常用的載體蛋白：牛血清白蛋白、卵清蛋白、明膠、血紅蛋白等。舉例：利用卵清固定化木瓜蛋白酶

（2）酶輔助蛋白交聯(lián)：現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹(shù)脂或其他大孔型離子交換樹(shù)脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱(chēng)為殼狀固定化酶。（3）吸附交聯(lián)法：現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。

（4）載體交聯(lián)法：現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三5、四種固定化酶制備方法的特點(diǎn)小結(jié)物理吸附包埋法共價(jià)結(jié)合法共價(jià)交聯(lián)法制備易易難難結(jié)合力弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中底物專(zhuān)一性無(wú)變化無(wú)變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低中高中制法特性現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三7.2固定化酶的特性：固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。固定化酶的最適溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。酶經(jīng)過(guò)固定化后，其作用的最適pH值往往會(huì)發(fā)生一些變化。固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。

現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三（一）影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素

酶經(jīng)過(guò)固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性質(zhì)和固定化過(guò)程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：

分配效應(yīng)

空間障礙效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀(guān)環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱(chēng)為宏觀(guān)環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個(gè)環(huán)境之間的不同分配，被稱(chēng)為分配效應(yīng)。

1、分配效應(yīng)現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制(因?yàn)檩d體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)不易與底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的活性中心對(duì)底物的定位作用,所造成的對(duì)固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱(chēng)為空間障礙效應(yīng)。

2、空間障礙效應(yīng)現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三

酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力：

1）、外擴(kuò)散阻力是底物從宏觀(guān)環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過(guò)程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周?chē)囊耗印Ｋ鼤?huì)使底物在固相酶周?chē)纬蓾舛忍荻?，通過(guò)增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。

2）、內(nèi)擴(kuò)散阻力是指底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時(shí)的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。

3、擴(kuò)散限制效應(yīng)現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期三7.3固定化酶的評(píng)價(jià)1、固定化酶的活力測(cè)定間歇測(cè)定連續(xù)測(cè)定2、