基因操作中大分子的分離和分析-08級(jí)課件

第二章

基因操作中大分子的分離和分析一、DNA的分離、檢測(cè)和純化二、RNA的分離、檢測(cè)和純化一、DNA的分離、檢測(cè)和純化1、DNA的組成與結(jié)構(gòu)2、DNA分子的重要特性3、染色體DNA的分離和純化4、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化5、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、DNA的組成和結(jié)構(gòu)Watson---美國(guó)生物學(xué)家,曾獲1962年諾貝爾生理學(xué)-醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

Crick---英國(guó)生物物理學(xué)家,曾獲1962年諾貝爾生理學(xué)-醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1953年Watson和Crick建立了DNA分子的雙螺旋模型.發(fā)表在《Nature》formconditionBaseturnRatpairHeightpairdiameterBrh92~95低Na+1036°3.38?19?Arh75,高Na+RNA-DNA1132.7°2.56?23?Z富含G-C高K+1230°3.71?18?幾種DNA構(gòu)型比較DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型變性(denaturation）:指在溫度、pH等因素作用下，DNA分子的氫鍵受到破壞，雙鏈分開(kāi)的過(guò)程。復(fù)性（renaturation)：是變性的逆過(guò)程，DNA互補(bǔ)配對(duì)成為雙鏈的過(guò)程。帶電性：一般pH下，帶負(fù)電荷，可電泳分離。水溶解性：DNA分子外形成水膜，可溶于水；但當(dāng)電荷變化（如等電點(diǎn)）或水膜破壞時(shí)，就會(huì)沉淀，這是提取和分離DNA的依據(jù)。2、DNA分子的重要特性3、染色體DNA的分離和純化真核、原核生物均有，103~106kb用于分離目的基因或基因表達(dá)調(diào)控因子（啟動(dòng)子（promoter））提供構(gòu)建染色體載體和染色體基因整合平臺(tái)細(xì)胞裂解：關(guān)系到能否提取到DNA以及影響DNA得率高低和質(zhì)量的關(guān)鍵步驟

細(xì)胞裂解緩沖液

100mmol/LTris-HCl,pH8.0100mmol/LEDTA250mmol/LNaCl

防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)DNA的降解

分離和抽提DNA：根據(jù)待提取的DNA的性質(zhì)，使其與細(xì)胞內(nèi)的其他組分分離。提取總DNA只須在細(xì)胞裂解液中加入適當(dāng)?shù)姆?氯仿/異戊醇(25:24:1)或氯仿/異戊醇(24:1)等有機(jī)溶液，可使DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)。用乙醇或異丙醇處理含DNA的水相，使其沉淀，離心獲得DNA堿裂解法提取E.coli質(zhì)粒DNA的原理

由Birnboim和Doly設(shè)計(jì)并于1979年發(fā)表。

在堿性條件下(pH12.0~12.5)線狀DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀。在高鹽條件下作復(fù)性處理，變性的染色體DNA會(huì)形成沉淀，從而將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開(kāi)。抽提/裂解緩沖液

溶液Ⅰ：滅菌后，4℃保存

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ⅱ：現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫下使用(pH12.0~12.5)0.2mol/L

NaOH1%SDS

溶液Ⅲ：滅菌后，4℃保存，用時(shí)冰浴(pH4.6)5mol/L乙酸鉀60ml

冰醋酸11.5ml

水28.5ml

溶液Ⅰ∶溶液Ⅱ∶溶液Ⅲ=1∶2∶1.5質(zhì)粒DNA的純化用苯酚/氯仿抽提去蛋白質(zhì)雜質(zhì)

一般先按1:1（V:V）用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)對(duì)DNA粗制品進(jìn)行抽提，然后用1:1（V:V）氯仿/異戊醇(24:1)再次抽提，以除去蛋白質(zhì)

用無(wú)水乙醇沉淀濃縮DNA

按2:1用無(wú)水乙醇（V:V）或1:1用異丙醇（V:V）在酸性條件下（加1/10體積的3MNaAcpH5.2）沉淀DNA。

用RNase去除RNA

Bio-Rab電泳儀電源水平電泳槽和一些梳子DNA泳動(dòng)方向溴化乙錠(EB)能摻入到雙鏈DNA中，在紫外光下會(huì)發(fā)出橙紅色的熒光。使用濃度：0.5μg/ml紫外線波長(zhǎng)：254nm

302nm366nmDNA泳動(dòng)方向是從負(fù)極向正極.一般使用的電壓為5V/cm.瓊脂糖凝膠Marker---DNA分子標(biāo)尺DNA點(diǎn)樣孔1000bp2500bp5000bp15000bp1000bp8000bp線性DNA分子開(kāi)環(huán)DNA分子二、RNA的分離、檢測(cè)和純化

1、RNA的組成與結(jié)構(gòu)特性2、RNA的抽提和純化3、mRNA的純化4、RNA的檢測(cè)5、RNA的電泳檢測(cè)1、RNA的組成與結(jié)構(gòu)特性mRNA:1~5%rRNA:80~85%(28S、18S和5S)tRNA/microRNA:15~20%2、RNA的抽提和純化溶液和用具的去RNA酶處理

RNA酶非常耐高溫，即使高溫滅菌也不可完全清除其活性。耐熱的物品：高溫干熱滅菌效果最好。微量移液吸頭和離心管：0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的水浸泡后在高溫滅菌。電泳用具：專(zhuān)用！用3%H2O2和0.1%DEPC水浸泡，清洗干凈。3、mRNA的純化

真核生物mRNA的3′端有一個(gè)poly(A)尾，可用親和層析的方法純化。(oligo(dT)-纖維素)

作用：構(gòu)建真核生物的cDNA文庫(kù)。復(fù)習(xí)內(nèi)容（P100~107）本章所講的知識(shí)點(diǎn)在隨后的實(shí)驗(yàn)課中均會(huì)涉及，希望同學(xué)們課后認(rèn)真復(fù)習(xí)！1、試驗(yàn)中所使用各種試劑的作用2、從核酸中