滅菌及空氣除菌

滅菌及空氣除菌第1頁/共139頁第五章發(fā)酵工業(yè)的滅菌及

空氣除菌第一節(jié)消毒與滅菌第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)第三節(jié)培養(yǎng)基與發(fā)酵設(shè)備的滅菌第四節(jié)空氣的除菌第2頁/共139頁目的要求：了解滅菌對發(fā)酵工業(yè)的意義，滅菌的原理及常用的方法。掌握培養(yǎng)基及發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法。了解生產(chǎn)中空氣除菌的基本方法、原理及設(shè)備。理解空氣凈化流程。

第3頁/共139頁幾個問題1、滅菌對發(fā)酵的意義2、滅菌的原理3、滅菌的方法4、滅菌的對象5、空氣的滅菌第4頁/共139頁滅菌的目的及內(nèi)容目的：為了保證純種并安全發(fā)酵內(nèi)容：培養(yǎng)基補(bǔ)料液（流加料）發(fā)酵過程的無菌控制空氣系統(tǒng)直接關(guān)系到發(fā)酵罐生產(chǎn)的成敗!管道系統(tǒng)環(huán)境：需要消毒第5頁/共139頁第一節(jié)消毒與滅菌一、控制有害微生物的主要措施

第6頁/共139頁二、幾個概念（一）滅菌（二）消毒（三）防腐（四）化療第7頁/共139頁（一）滅菌（sterilization）滅菌：（p128）采用理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。Sterilization就是失去繁殖力。例如各種高溫滅菌措施等。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。第8頁/共139頁第9頁/共139頁（二）消毒從字義上來看，消毒就是消除毒害，這里的“毒害”就是指傳染源或致病菌的意思。消毒:是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。第10頁/共139頁（三）防腐（antisepsis）防腐:就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。（1）低溫（2）缺氧（3）干燥（4）高滲（5）高酸度（6）防腐劑第11頁/共139頁（四）化療（chemotherapy）化療:即化學(xué)治療。它是利用具有高度選擇毒力（即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。用于化療目的的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)治療劑。最重要的化學(xué)治療劑如各種抗生素、磺胺類藥物和中草藥中的有效成分等。第12頁/共139頁第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)常用的除菌方法（p128-129）一、高溫滅菌：干熱滅菌和濕熱滅菌?；鹧鏈缇航臃N時用。二、射線滅菌：用紫外線、高能電磁波或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進(jìn)行滅菌的方法。三、化學(xué)藥劑滅菌：一些化學(xué)藥劑能與微生物反應(yīng)而具殺菌作用。適用于環(huán)境、設(shè)備等方面的消毒，一般不用于培養(yǎng)基的滅菌。四、過濾除菌：利用過濾方法阻留微生物，達(dá)滅菌目的。適用于澄清流體（如氣體和液體）的除菌以及熱敏性培養(yǎng)基的除菌。第13頁/共139頁一、高溫殺菌（一）高溫致死原理（二）高溫滅菌的方法（三）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止（四）滅菌設(shè)備第14頁/共139頁（一）高溫致死原理高溫使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞。例如它可使核酸發(fā)生脫氨、脫嘌呤或降解，以及破壞細(xì)胞膜上的類脂質(zhì)成分等。第15頁/共139頁（二）高溫滅菌的方法第16頁/共139頁1．干熱滅菌法干熱滅菌法：將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱干燥箱內(nèi)，在160～170℃下維持1～2h后，即可達(dá)到徹底滅菌的目的。原因：在這種條件下，可使細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)變性、原生質(zhì)干燥，以及各種細(xì)胞成分發(fā)生氧化。適用對象：玻璃器皿、金屬材料、耐高溫物品。灼燒：是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數(shù)對象的滅菌。第17頁/共139頁2．濕熱滅菌法濕熱滅菌法：利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌法與干熱滅菌法的比較：濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效，這一方面是由于濕熱易于傳遞熱量，另一方面是由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性。方法：常壓和高壓。微生物的耐熱情況：多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理5～10min后即可殺死；酵母菌和真菌的孢子稍耐熱些，要用80℃以上的溫度處理才能殺死；細(xì)菌的芽孢最耐熱，一般要在121℃下處理15min才能殺死。第18頁/共139頁（1）常壓法巴氏消毒法：

用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進(jìn)行高溫滅菌的液體的一種消毒方法，其主要目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結(jié)核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風(fēng)味。它是一種低溫消毒法。低溫維持法：在63℃下保持30min可進(jìn)行牛奶消毒；高溫瞬時法：用于牛奶消毒時只要在72℃下保持15秒鐘即可。第19頁/共139頁間歇滅菌法：又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。方法：將待滅菌的培養(yǎng)基在80～100℃下蒸煮15～60min，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37℃下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。用途：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。第20頁/共139頁（2）加壓法常規(guī)加壓滅菌法:將盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅(qū)盡氣體后將鍋密閉。分為兩種具體的方法：①再繼續(xù)加熱至121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），時間維持15～20min；②或采用在較低的溫度115℃，（即壓力為0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下維持35min。用途：一切微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。第21頁/共139頁

連續(xù)加壓滅菌法——“連消法”用途：只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。主要操作：將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進(jìn)行加熱、維持和冷卻，然后才進(jìn)入發(fā)酵罐。方法：培養(yǎng)基一般在135～140℃下處理5～15秒鐘以達(dá)到滅菌的目的。

第22頁/共139頁連續(xù)加壓滅菌法優(yōu)點(diǎn)：

①因采用高溫瞬時滅菌，故既可殺滅微生物，又可最大限度減少營養(yǎng)成分的破壞，從而提高了原料的利用率，比“實(shí)罐滅菌”（121℃，30min）提高產(chǎn)量5～10％；②由于總的滅菌時間較分批滅菌注明顯減少，所以縮短了發(fā)酵罐的占用周期，從而提高了它的利用率；③由于蒸汽負(fù)荷均勻，故提高了鍋爐的利用率；④適宜于自動化操作；⑤降低了操作人員的勞動強(qiáng)度。第23頁/共139頁影響加壓蒸汽滅菌效果的因素

（1）滅菌物體含菌量的影響（2）滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響（3）滅菌對象pH的影響（4）滅菌對象的體積（5）加熱與散熱速度第24頁/共139頁（1）滅菌物體含菌量的影響天然原料尤其是麩皮等植物性原料配成的培養(yǎng)基，一般含菌量較高，而用純粹化學(xué)試劑配制成的組合培養(yǎng)基，含菌量低。第25頁/共139頁（2）滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響檢驗(yàn)滅菌鍋內(nèi)空氣排除度，可采用多種方法。最好的辦法是滅菌鍋上同時裝有壓力表和溫度計(jì)，其次是將待測氣體通過橡膠管引入深層冷水中，如只聽到“撲撲”聲而未見有氣泡冒出，也可證明鍋內(nèi)已是純蒸汽了。

第26頁/共139頁（3）滅菌對象pH的影響（4）滅菌對象的體積要防止用常規(guī)的壓力和時間在加壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行大容量培養(yǎng)基的滅菌。（5）加熱與散熱速度這兩段也對滅菌效果和培養(yǎng)基成分發(fā)生影響。為了使科學(xué)研究的結(jié)果有良好的重演性，在滅菌操作中對這些技術(shù)細(xì)節(jié)都應(yīng)加以注意。

第27頁/共139頁（三）高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止

第28頁/共139頁消除高溫有害影響的措施：（1）采用特殊加熱滅菌法

（2）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并。（3）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀。第29頁/共139頁（4）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下滅菌15min）或間歇滅菌。（5）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌。第30頁/共139頁1.高壓蒸汽滅菌設(shè)備

2．常壓蒸汽滅菌鍋（四）滅菌設(shè)備

第31頁/共139頁1.高壓蒸汽滅菌設(shè)備

手提式滅菌鍋：容量小，多用于母種培養(yǎng)基滅菌。立式或臥式滅菌鍋：較大，多用于原種或少量栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。滅菌柜：要和蒸汽鍋爐配套，用于大量的原種和栽培種培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。但投資太大，適合大型菌種場使用。第32頁/共139頁第33頁/共139頁2．常壓蒸汽滅菌鍋

常壓蒸汽滅菌鍋是用鐵鍋、磚、水泥砌成的，造價低，適于一般生產(chǎn)單位和專業(yè)戶使用。大小可根據(jù)需要而定，但最大的鍋每次裝料也最好不超過500Kg。

3．烘箱

烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和滅菌，也可用于其它物品烘干。

第34頁/共139頁二、射線滅菌射線滅菌：是用紫外線、高能電磁波或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進(jìn)行滅菌的方法。常用的方法：波長為2537A°的紫外線，多用于表面及空氣消毒。

0.06～1.4A°的X射線。

C060產(chǎn)生的γ射線。微波滅菌等。第35頁/共139頁三、化學(xué)殺菌劑或制菌劑第36頁/共139頁（一）表面消毒劑表面消毒劑：是指對一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)治療用的化學(xué)藥劑。常用消毒劑的種類很多，它們的殺菌強(qiáng)度各不相同。但幾乎都有一個共同規(guī)律，即當(dāng)其在極低濃度時，常常會對微生物的生命活動起刺激作用，隨著濃度逐漸增高，就相繼出現(xiàn)制菌和殺菌作用，因而形成一個連續(xù)的作用譜。適用：環(huán)境以及物體表面的消毒．第37頁/共139頁（二）石炭酸系數(shù)為比較各種表面消毒劑的相對殺菌強(qiáng)度，常采用在臨床上最早使用的消毒劑——石炭酸作為比較的標(biāo)準(zhǔn)，并提出了石炭酸系數(shù)這一指標(biāo)。石炭酸系數(shù)：指在一定時間內(nèi)被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規(guī)定處理時間為10min，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。

第38頁/共139頁第39頁/共139頁四、過濾除菌過濾除菌：將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。適用：澄清流體（如氣體和液體）的除菌熱敏性培養(yǎng)基的除菌工業(yè)生產(chǎn)中用于制備無菌空氣產(chǎn)品提取過程中處理料液而獲得無菌產(chǎn)品（尤其適合對熱不穩(wěn)定的物質(zhì)）。在實(shí)際生產(chǎn)中，以上幾種方法有時根據(jù)情況可結(jié)合使用。如制備培養(yǎng)基時，其中一些成分對熱敏感（如氨基酸、維生素等）就要用過濾方法除菌。而其它物質(zhì)可用蒸汽滅菌，最后合并使用。第40頁/共139頁目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。濾膜過濾裝置:燒結(jié)玻璃濾板過濾器、石棉板過濾器（Seitz濾器）、素?zé)蛇^濾器以及硅藻土過濾器等。過濾除菌的缺點(diǎn)：是無法去除其中的病毒和噬菌體。第41頁/共139頁常見的過濾器濾膜孔徑：0.22、0.45μm?？梢詳r截的微生物：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。除病毒需要的濾膜孔徑：0.04μm。第42頁/共139頁醋酸纖維素膜過濾器攔截的

大腸桿菌圖片第43頁/共139頁板式膜分離器（實(shí)驗(yàn)室用）第44頁/共139頁中空纖維膜分離器（實(shí)驗(yàn)室用）第45頁/共139頁中空纖維膜分離器（工業(yè)用）第46頁/共139頁第三節(jié)

培養(yǎng)基與發(fā)酵設(shè)備的滅菌

培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌的方法（p129-137）

——高壓蒸汽濕熱滅菌法一、濕熱滅菌的基本原理二、影響培養(yǎng)基滅菌的因素三、滅菌的實(shí)際操作第47頁/共139頁原理：濕熱滅菌是直接用蒸汽滅菌。蒸汽冷凝時釋放大量潛熱，并具有強(qiáng)大的穿透力，在高溫和水存在時，微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)極易發(fā)生不可逆的凝固性變性，致使微生物在短時間內(nèi)死亡。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時間：殺死全部微生物所需的時間。由于濕熱滅菌有經(jīng)濟(jì)和快速等特點(diǎn)，因此被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)。一、濕熱滅菌的基本原理第48頁/共139頁用蒸汽加熱的方法對培養(yǎng)基滅菌的要求:既要達(dá)到一定的滅菌程度。又要盡量減少營養(yǎng)成分的破壞。第49頁/共139頁（一）理論滅菌時間

某些分子的分解和分子內(nèi)部的重新排列的反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)。雜菌雖然是一個復(fù)雜的高分子體系，但其受熱被殺死，主要原因是高溫能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)，因此，雜菌在一定溫度下受熱死亡也遵循單分子反應(yīng)方程。

第50頁/共139頁微生物受熱死亡的定律——

對數(shù)殘留定律：計(jì)算滅菌時間的基本公式——對數(shù)殘留方程：

t=(2.303/k)·log(No/Nt)t---滅菌時間（s）k---滅菌反應(yīng)速度常數(shù)，與菌的種類和滅菌溫度有關(guān)（s－１）No---滅菌開始時，培養(yǎng)基中雜菌個數(shù)（個／ml）---經(jīng)過滅菌時間t后，殘存活菌個數(shù)（個／ml）

滅菌時間與污染程度（No）、滅菌程度（Nt）和滅菌反應(yīng)速度常數(shù)（k）有關(guān)。滅菌時間和溫度呈反比關(guān)系。（p130）第51頁/共139頁（二）滅菌溫度與滅菌反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系

滅菌溫度與滅菌反應(yīng)速度常數(shù)的關(guān)系——阿侖烏斯定律：

k=Ae-E/RT

K——滅菌反應(yīng)速度常數(shù)（s-1）A——阿侖烏斯常數(shù)（s-1）E——活化能（J／mol）R——?dú)怏w常數(shù)4.1868×1.98J／（mol·K）T——絕對溫度（K）滅菌溫度越低，K值越小，滅菌時間越長；反之，滅菌溫度越高，K值越大，則滅菌時間越短。（p130-131）第52頁/共139頁殺死細(xì)菌和芽孢的溫度和時間：一般根據(jù)試驗(yàn)確定?；蛘吒鶕?jù)推算確定。p131第53頁/共139頁二、影響培養(yǎng)基滅菌的因素

(p134-135)

1、培養(yǎng)基成分2、培養(yǎng)基的物理狀態(tài)3、培養(yǎng)基pH值的影響4、微生物細(xì)胞含水量5、培養(yǎng)基中微生物的性質(zhì)與數(shù)量6、冷空氣排除情況7、泡沫8、攪拌第54頁/共139頁1、培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基的成分中，油脂、糖類、蛋白質(zhì)都是傳熱的不良介質(zhì)，會增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。濃度較高的培養(yǎng)基相對需要較高溫度和較長時間滅菌。高濃度的鹽類，色素則削弱其耐熱性，故較易滅菌。天然培養(yǎng)基不易滅菌，而化學(xué)合成培養(yǎng)基較易滅菌。第55頁/共139頁2、培養(yǎng)基的物理狀態(tài)培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說來，含有小于1mm顆粒的培養(yǎng)基對滅菌影響不大。但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，特別是存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時，會影響滅菌效果，必須過濾除去。第56頁/共139頁3、培養(yǎng)基的pH值pH值對微生物的耐熱性影響很大：pH為6.0～8.0時微生物最不易死亡pH＜6.0時，氫離子易滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)，促使其死亡，縮短滅菌時間。培養(yǎng)基pH與滅菌時間的關(guān)系見p134表5-4。第57頁/共139頁4、微生物細(xì)胞含水量微生物細(xì)胞含水量越少，越耐熱，滅菌時間越長。孢子、芽孢的含水量少，要長時間，高溫才能將其殺死。第58頁/共139頁5、微生物性質(zhì)與數(shù)量微生物的種類不同，耐熱情況不同。因此，采用的滅菌溫度不同。細(xì)菌、酵母菌的營養(yǎng)體、霉菌的菌絲體對熱敏感；放線菌、酵母菌、霉菌的孢子，細(xì)菌的芽孢等，對熱的抵抗力強(qiáng)。處于不同生長時期的微生物耐熱不同，采用的溫度不同。數(shù)量多滅菌的時間長，含芽孢滅菌的時間長。第59頁/共139頁6、冷空氣排除情況高壓蒸汽滅菌鍋中的冷空氣對滅菌效果影響很大。原因：冷空氣導(dǎo)熱性能差。降低高壓鍋內(nèi)的蒸汽分壓使之不能達(dá)到應(yīng)有的溫度。因此，滅菌器內(nèi)的冷空氣一定要排除徹底，否則高壓鍋內(nèi)的實(shí)際溫度要低于壓力表所對應(yīng)的溫度，達(dá)不到滅菌效果?？諝馀懦潭扰c溫度的關(guān)系，見p135表5-6。第60頁/共139頁7、泡沫泡沫中的空氣形成隔熱層，使傳熱困難，所以要消泡。第61頁/共139頁8、攪拌攪拌的作用：不至于造成局部過熱或滅菌死角的情況，在保證不過多的破壞培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的前提下，達(dá)到徹底滅菌的目的。第62頁/共139頁三、滅菌的實(shí)際操作

（p131-137）

（一）發(fā)酵罐和液體培養(yǎng)基的滅菌（二）固體培養(yǎng)基的滅菌（三）其他設(shè)備的滅菌第63頁/共139頁

（一）發(fā)酵罐和液體培養(yǎng)基的

滅菌發(fā)酵罐滅菌包括：種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌等。滅菌的方法：發(fā)酵罐的滅菌方法：空消、實(shí)消液體培養(yǎng)基的滅菌方法：分批滅菌（實(shí)消）、連續(xù)滅菌（連消）滅菌具體的方法：１、空罐滅菌（空消）2、實(shí)罐滅菌（實(shí)消，分批滅菌）3、連續(xù)滅菌（連消）第64頁/共139頁（一）發(fā)酵罐和液體培養(yǎng)基的

滅菌發(fā)酵罐滅菌包括：種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌等。滅菌的方法：發(fā)酵罐的滅菌方法：空消、實(shí)消液體培養(yǎng)基的滅菌方法：分批滅菌（實(shí)消）、連續(xù)滅菌（連消）滅菌具體的方法：１、空罐滅菌（空消）2、實(shí)罐滅菌（實(shí)消，分批滅菌）3、連續(xù)滅菌（連消）第65頁/共139頁１、空罐滅菌（空消）p137空罐滅菌：無論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進(jìn)罐前對罐進(jìn)行預(yù)先滅菌，為空罐滅菌。方法：一般從管道通入蒸汽，使罐內(nèi)壓力為0.147MPa，維持40min，滅菌結(jié)束，關(guān)閉蒸汽，在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無菌空氣，使容器保持正壓（0.098MPa），防止形成真空而吸入帶菌的空氣。第66頁/共139頁空罐滅菌的特點(diǎn)：為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時間較長，只有這樣才能殺死設(shè)備中各死角殘存的雜菌或芽孢。第67頁/共139頁2、實(shí)罐滅菌（分批滅菌）p131-132實(shí)罐滅菌：將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后，維持一定時間，再冷卻到接種溫度，然后接種發(fā)酵的滅菌方法，又稱分批滅菌、間歇滅菌。即發(fā)酵罐、種子罐等和培養(yǎng)基一起的滅菌。操作要求：為達(dá)到良好的滅菌效果，不留死角，應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行操作。它包括升溫、保溫、降溫三個階段。適用：中小型發(fā)酵罐和種子罐的滅菌。

第68頁/共139頁實(shí)罐滅菌的特點(diǎn)：（p132）優(yōu)點(diǎn)：（1）不需專門滅菌設(shè)備，在發(fā)酵罐中滅菌即可。（2）投入少，操作簡單。（3）滅菌效果可靠，對蒸汽要求低，一般（3～4）×10５

Pa（表壓）即可。滅菌標(biāo)準(zhǔn)是121℃，15～30min。（4）適合含有固體顆粒、較多泡沫、粘度大的培養(yǎng)基的滅菌。缺點(diǎn)：（1）易發(fā)生過熱破壞培養(yǎng)基營養(yǎng)的現(xiàn)象。（2）能耗增加。（3）發(fā)酵周期延長。（4）降低發(fā)酵罐的利用率。第69頁/共139頁3、連續(xù)滅菌（連消）p132-133連消：液體培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌又稱連消。就是將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐輸送的同時進(jìn)行加熱、保溫和冷卻的過程，從而達(dá)到滅菌的效果。適用：發(fā)酵培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、補(bǔ)料等液體培養(yǎng)基滅菌。第70頁/共139頁連續(xù)滅菌的特點(diǎn)：

（p132-133）優(yōu)點(diǎn)：（1）培養(yǎng)液受熱時間短，既能達(dá)滅菌要求又能減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的破壞。（2）在培養(yǎng)基連續(xù)滅菌過程中，蒸汽用量平衡，但蒸汽壓力一般要求高于5×10５Pa（表壓）。滅菌標(biāo)準(zhǔn)是126-132℃，5-8min。（3）設(shè)備利用率高，適于自動控制。缺點(diǎn)：（1）所用設(shè)備多而復(fù)雜，投資較大。（2）染菌機(jī)會大。（3）不適合含有大量固體顆粒培養(yǎng)基的滅菌。第71頁/共139頁

培養(yǎng)基連續(xù)滅菌的主要設(shè)備：加熱器（連消塔）維持罐（或管）冷卻器（噴淋或真空冷卻器）第72頁/共139頁幾種加熱器：第73頁/共139頁培養(yǎng)基連消工藝流程圖：（p133）第74頁/共139頁第75頁/共139頁噴射加熱連續(xù)滅菌流程：

特點(diǎn):蒸汽直接噴入生的培養(yǎng)液，溫度幾乎直接上升到預(yù)定殺菌溫度，由保溫段管子的長度來保證必要的殺菌時間。第76頁/共139頁薄板換熱器連續(xù)滅菌流程：

特點(diǎn)：效率高，利用冷的培養(yǎng)液作冷卻劑。既冷卻了熱的培養(yǎng)基又預(yù)熱了冷的培養(yǎng)液，節(jié)約用水和蒸汽。并且可在20S內(nèi)達(dá)到殺菌溫度，經(jīng)保溫段保持必要的殺菌時間，然后在板式熱交換器另一段，20S內(nèi)冷卻到發(fā)酵溫度。

熱交換器水20℃31℃進(jìn)料35℃120℃120℃147℃120℃55℃出料35℃100℃第77頁/共139頁（二）固體培養(yǎng)基的滅菌（p133）1、方法：采用旋轉(zhuǎn)蒸煮鍋也稱轉(zhuǎn)鼓式滅菌器（滅菌蒸汽壓力0.098MPa，維持20～30min）進(jìn)行滅菌。2、用途：固體曲、固體發(fā)酵原料的滅菌。3、固體培養(yǎng)基的特點(diǎn)：呈片狀或粒狀，不易翻動，吸水后加熱易成團(tuán)，熱傳遞性能差，冷卻困難。第78頁/共139頁4、旋轉(zhuǎn)蒸煮鍋結(jié)構(gòu)有單頭（出口）和雙頭兩種，由鋼板焊制能承受一定壓力。鍋中心有帶孔空心橫軸，蒸汽沿軸中心通入鍋內(nèi)加熱；滅菌結(jié)束后用真空泵抽氣，以降壓和降溫。軸裝在支架兩端的軸承中，借齒輪轉(zhuǎn)動（0.5～1r/min）。第79頁/共139頁（三）其他設(shè)備及物品的滅菌（p137）1、玻璃器皿及用具的滅菌：

壓力為0.098MPa，維持30～60min。2、空氣總過濾器和分過濾器滅菌：壓力為0.174MPa，維持2h，滅菌完畢，通入壓縮空氣吹干。3、消泡劑滅菌：

121℃，保溫30min。4、尿素溶液滅菌：

105℃，保溫5min。淀粉料液的滅菌：121℃，保溫30min。5、各管路的滅菌：0.3～0.45MPa，保溫1h。第80頁/共139頁第四節(jié)空氣的除菌

（p137-148）

一、空氣除菌的原因二、空氣除菌的方法三、介質(zhì)過濾除菌四、空氣介質(zhì)過濾除菌設(shè)備五、發(fā)酵生產(chǎn)中空氣凈化的工藝流程第81頁/共139頁一、空氣除菌的原因（一）空氣中微生物的分布空氣中微生物的含量和種類，隨地區(qū)，季節(jié)和空氣中灰塵粒子多少，以及人們的活動情況而異。北方氣候干燥，寒冷，空氣中的含菌量較多，離地面越高，含菌量越少；一般每升高10m，空氣中的含菌量就降低一個數(shù)量級；城市的空氣中含菌量較多，農(nóng)村的空氣中含菌量較少，一般城市空氣中雜菌數(shù)為103～104個／m3

。第82頁/共139頁空氣中的微生物種類:以細(xì)菌和細(xì)菌芽胞較多，也有酵母，霉菌和病毒。這些微生物大小不一，一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上。灰塵粒子的平均大小約0.6μm左右，所以空氣除菌主要是去除空氣中的微粒(0.6～1μm）第83頁/共139頁（二）空氣除菌的原因

1.空氣中存在有大量的各種各樣的微生物

（工業(yè)設(shè)計(jì)中常以微生物濃度104個/m3作為空氣的污染指標(biāo)。）2.空氣中存在著潤滑油、灰塵顆粒、水蒸汽等。（由于深層發(fā)酵所用空氣需一定壓力，空氣經(jīng)壓縮機(jī)壓縮后，將夾帶大量的油滴和水霧。如它們進(jìn)入過濾介質(zhì)的纖維間，將阻塞通道，甚至使過濾介質(zhì)結(jié)塊，完全喪失其除菌作用，所以要除去這些物質(zhì)。）第84頁/共139頁二、空氣除菌的方法

（一）工業(yè)發(fā)酵對空氣質(zhì)量的要求隨發(fā)酵產(chǎn)品和菌種不同而異：半固體制曲和酵母生產(chǎn)中無菌要求不十分嚴(yán)格，一般無需復(fù)雜的空氣凈化處理。密閉的深層通氣發(fā)酵需嚴(yán)格的純凈培養(yǎng)，進(jìn)入發(fā)酵罐前空氣必須進(jìn)行冷卻、脫水、脫油和過濾除菌等處理（如氨基酸、抗生素等）。同一工廠的不同生產(chǎn)區(qū)域（環(huán)節(jié)）有不同的空氣無菌度的要求。第85頁/共139頁（二）發(fā)酵對空氣無菌程度的要求好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣，空氣要作到絕對無菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟(jì)的。無菌空氣：通過除菌處理使空氣中含菌量降到零或者極低從而使污染的可能性降至極小。發(fā)酵對無菌空氣的要求：無菌，無灰塵，無雜質(zhì)，無水，無油，正壓等幾項(xiàng)指標(biāo)。發(fā)酵對無菌空氣的無菌程度要求：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。一般按染菌率計(jì)算，在工程設(shè)計(jì)中一般要求染菌率為10-3

即1000次發(fā)酵無菌空氣使用周期中只允許一次染菌。第86頁/共139頁一般空氣無菌程度是用空氣潔凈度表示。空氣潔凈度：潔凈環(huán)境中空氣含塵量多少的程度。空氣潔凈度的高低是用空氣潔凈度級別來區(qū)分的。空氣潔凈度級別是用操作時間內(nèi)空氣的計(jì)數(shù)含塵量表示。環(huán)境空氣的潔凈程度：p138第87頁/共139頁（三）空氣除菌的方法（p141-146）

空氣除菌：就是除去或殺死空氣中的微生物。常用的方法：加熱殺菌輻射殺菌

靜電除菌過濾除菌

第88頁/共139頁1、加熱滅菌原理：基于加熱后微生物體內(nèi)的蛋白（酶）熱變性而得以實(shí)現(xiàn)。熱空氣進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般均需用壓縮機(jī)壓縮，提高壓力?？諝鈮嚎s后溫度能達(dá)到200℃以上，保持一定時間后，便可實(shí)行干熱殺菌。第89頁/共139頁熱殺菌：

空氣熱滅菌流程示意圖1-空氣壓縮機(jī)2-粗過濾器3-保溫管4-貯氣罐5-保溫罐6-列管式冷卻器7-渦輪壓縮機(jī)8-預(yù)熱器9-粗過濾器10-空氣吸入塔第90頁/共139頁利用空氣壓縮時所產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌的原理對制備大量無菌空氣有特別意義。實(shí)際應(yīng)用中需考慮培養(yǎng)裝置與空氣壓縮機(jī)的相對位置，連接壓縮機(jī)與培養(yǎng)裝置的管道的滅菌以及管道長度等。熱殺菌流程見p141。第91頁/共139頁2．輻射滅菌法

原理：2537?波長的紫外線具有極強(qiáng)烈的殺菌效力，它的主要作用是使微生物的DNA分子產(chǎn)生的胸腺嘧啶的二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。應(yīng)用：表面滅菌、無菌室滅菌。無菌室常用的紫外燈功率為30W，安裝在操作臺上方一米左右高處，每次照射15～30min既可。特點(diǎn)：紫外線有很強(qiáng)的殺菌力，但穿透力很弱，一張薄紙即可完全擋住紫外線，因此待滅菌物品必須置于紫外光直接照射下，而且在一定范圍內(nèi)作用強(qiáng)度與距離平方成反比。第92頁/共139頁超凈工作臺第93頁/共139頁注意事項(xiàng)：此外，紫外線對人體組織有一定刺激作用，眼睛、皮膚受照射后會產(chǎn)生某些癥狀，所以工作人員在無菌室操作時應(yīng)關(guān)閉紫外燈。注意第94頁/共139頁3、靜電除菌靜電除塵器可除去空氣中的水霧、油霧、塵埃，同時也除去微生物。原理：利用靜電引力來吸附帶電粒子而達(dá)到除塵滅菌目的。對于一些直徑小的微粒，所帶電荷小，不能被吸附而沉降。應(yīng)用：潔凈工作臺。電

除

塵

電

源

第95頁/共139頁靜電除塵器裝置圖：第96頁/共139頁4、介質(zhì)過濾除菌

介質(zhì)過濾除菌：是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。特點(diǎn)：從可靠性、經(jīng)濟(jì)適用與便于控制等方面考慮，目前仍以介質(zhì)過濾法較好，也是大多數(shù)發(fā)酵廠廣泛采用的方法。第97頁/共139頁三、介質(zhì)過濾除菌（p143-146）（一）介質(zhì)過濾除菌的材料（二）介質(zhì)過濾除菌的原理（三）影響介質(zhì)過濾效率的因素（四）提高過濾除菌效率的措施第98頁/共139頁（一）介質(zhì)過濾除菌的材料

（p143-145）１、棉花：纖維細(xì)長，16～20μm，填充150～200kg/m3。２、玻璃纖維：直徑8～19μm，直徑越小越好，但小易斷。缺點(diǎn)：更換時碎末飛揚(yáng)，過敏。３、活性炭：大表面，物理吸附，空氣阻力小，常夾帶在二層棉花中降低阻力，為整個過濾器的1/3～1/2。４、超細(xì)玻璃纖維紙:以攔截為主，直徑1～1.5μm，有較高過濾效率。缺點(diǎn)為強(qiáng)度差，受溫后纖維松散。只用于分過濾器?？杉尤肽緷{纖維或其他纖維或采用樹脂并加疏松劑。

第99頁/共139頁５、石棉濾板：藍(lán)石棉20％加80％紙將混合打漿。溫強(qiáng)度大，過濾效率低，耐蒸氣反復(fù)殺菌。６、燒結(jié)材料過濾介質(zhì)：聚乙烯醇過濾板。７、新型過濾介質(zhì)：微孔濾膜。第100頁/共139頁（二）介質(zhì)過濾除菌的原理（p145）1、概述目前發(fā)酵工廠采用的空氣過濾設(shè)備大多數(shù)是傳統(tǒng)的深層過濾設(shè)備，濾層厚度一般為1～2米，所用的過濾介質(zhì)一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纖維、焦炭等。對不同的材料，材料的不同規(guī)格，材料的填充情況不同，都會得到不同的過濾效果。為了制取適合要求的無菌空氣，就得深入研究深層過濾的各種關(guān)系。

第101頁/共139頁2、深層過濾原理深層過濾所用的過濾介質(zhì)——棉花的纖維直徑一般為16～20μm。充填系數(shù)為8%時，棉花纖維所形成網(wǎng)格的孔隙為20～50μm，微粒大小為(0.5～2μm)。過濾除菌原理:深層過濾所用介質(zhì)的間隙，一般大于固體顆粒（微生物細(xì)胞），但空氣中的菌體還能夠除去的原因是：微粒隨氣流通過濾層時，濾層纖維所形成的網(wǎng)格阻礙氣流前進(jìn)，使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動速度和運(yùn)動方向，繞過纖維前進(jìn)。這些改變引起微粒以對濾層纖維產(chǎn)生慣性沖擊、阻攔、重力沉降、布朗擴(kuò)散、靜電吸引等作用而把微粒滯留在纖維表面上。第102頁/共139頁（1）布朗擴(kuò)散截留作用布朗擴(kuò)散：直徑很小的微粒在很慢的氣流中產(chǎn)生的不規(guī)則的直線運(yùn)轉(zhuǎn)稱為布朗擴(kuò)散。作用的條件：氣流速度很慢、纖維間隙較小。作用的結(jié)果：增加了微粒與纖維的接觸滯留機(jī)會，被截留在纖維上。第103頁/共139頁（2）攔截截留作用在慣性截留作用為零的氣流速度以下（臨界氣流速度），當(dāng)微生物等微粒隨氣流慢慢靠近纖維時，受纖維所阻改變氣流方向，繞過纖維前進(jìn)，在纖維周邊形成一層邊界滯留區(qū)。滯留區(qū)的速度更慢。進(jìn)入滯留區(qū)的微粒就容易被纖維黏附截留。第104頁/共139頁（3）慣性撞擊截留作用微粒隨氣流通過濾層時，濾層纖維縱橫交錯所形成的網(wǎng)格阻礙氣流前進(jìn)，使氣流不斷改變運(yùn)動速度和運(yùn)動方向。由于微生物顆粒的慣性大于空氣，所以當(dāng)空氣流遇阻而繞道前進(jìn)時，微生物顆粒由于不能及時的改變它的運(yùn)動方向，結(jié)果就撞擊纖維并被截留在纖維的表面。第105頁/共139頁（4）重力沉降作用機(jī)理：重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。就單一的重力沉降情況下，大顆粒比小顆粒作用顯著，對于小顆粒只有在氣流速度很慢時才起作用。一般它是與攔截作用相配合的，即在纖維的邊界滯留區(qū)內(nèi)，微粒的沉降作用提高了攔截滯留的捕集效率。第106頁/共139頁（5）靜電吸附作用機(jī)理：干空氣對非導(dǎo)體的物質(zhì)相對運(yùn)動磨擦?xí)r，會產(chǎn)生誘導(dǎo)電荷，纖維和樹脂處理過的纖維，尤其是一些合成纖維更為顯著。這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。懸浮在空氣中的微生物微粒大多帶有不同的電荷。如枯草桿菌孢子20%帶正電荷，20%帶負(fù)電荷，15%中性，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。第107頁/共139頁此外，表面吸附也歸屬于這個范疇，如活性炭的大部分過濾效能應(yīng)是表面吸附的作用。第108頁/共139頁（三）影響介質(zhì)過濾效率的因素1、介質(zhì)纖維直徑介質(zhì)過濾效率與介質(zhì)纖維直徑關(guān)系很大，在其他條件相同時，介質(zhì)纖維直徑越小，過濾效率越高。2、對于相同介質(zhì)，過濾效率與介質(zhì)濾層厚度、介質(zhì)填充密度和空氣流量有關(guān)。第109頁/共139頁（四）提高過濾除菌效率的措施鑒于目前所采用的過濾介質(zhì)均需要干燥條件下才能進(jìn)行除菌，因此需要圍繞介質(zhì)來提高除菌效率。（1）設(shè)計(jì)合理的空氣預(yù)處理設(shè)備，選擇合適的空氣凈化流程，以達(dá)到除油、水和雜質(zhì)的目的。（2）設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)。（3）保證進(jìn)口空氣清潔度，如加強(qiáng)生產(chǎn)場地衛(wèi)生管理，正確選擇進(jìn)風(fēng)口，加強(qiáng)空氣壓縮前的預(yù)處理。（4）降低進(jìn)入空氣過濾器的空氣相對濕度，如使用無油潤滑的空氣壓縮機(jī)，加強(qiáng)空氣冷卻和去油，提高進(jìn)入過濾器的空氣溫度。第110頁/共139頁（五）過濾器失效壓縮空氣進(jìn)入過濾器后便引起活性炭顆粒之間相互頂撞與摩擦，久而成為粉末(灰化)，活性炭的體積也逐漸變小，于是過濾器內(nèi)的空間逐漸增大，到達(dá)一定程度時，便會發(fā)生棉花成90°翻身現(xiàn)象。這樣空氣便會未經(jīng)過濾而進(jìn)入罐內(nèi)，引起染菌。第111頁/共139頁棉花經(jīng)過多次加熱滅菌后，顏色逐漸變深，靠近過濾器壁的棉花，因經(jīng)受夾層蒸汽的烤干，受熱更為劇烈，更容易變成粉末，而被空氣帶走，造成過濾層有縫隙，使過濾層疏松而漏風(fēng)，甚至還因過高的壓力和過長時間的烘烤而引起棉花活性炭著火的事故。因此，要注意更換棉花。第112頁/共139頁四、空氣介質(zhì)過濾除菌設(shè)備（一）采風(fēng)塔（二）粗過濾器（三）空氣壓縮機(jī)（四）空氣貯罐（五）空氣冷卻器（六）氣液分離器（七）空氣加熱器第113頁/共139頁高空取氣管：高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據(jù)資料介紹，每升高10m，空氣中雜菌可降低一個數(shù)量級，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。第114頁/共139頁粗過濾器油浴洗滌空氣裝置水霧除塵裝置第115頁/共139頁纖維介質(zhì)深層過濾器：

深層纖維介質(zhì)空氣過濾器進(jìn)氣口壓緊架出氣口纖維介質(zhì)換熱夾套活性炭第116頁/共139頁第117頁/共139頁空氣貯罐作用：消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈沖，維持穩(wěn)定的空氣壓力，同時也可以利用重力沉降作用分離部分油霧。安全閥壓力表排氣管人孔進(jìn)氣管第118頁/共139頁空氣冷卻器常用的類型有：立式列管式熱交換器、沉浸式熱交換器、噴淋式熱交換器和板翹式熱交換器等。第119頁/共139頁氣液分離器作用：將空氣中被冷凝成霧狀的水霧和油霧粒子除去的設(shè)備。一般常用的有旋風(fēng)式和填料式。第120頁/共139頁氣液分離器填料式分離器是利用各種填料如焦炭、活性炭、磁環(huán)、金屬絲網(wǎng)、塑料絲網(wǎng)等的慣性攔截作用分離空氣中水霧或油霧。第121頁/共139頁油水分離器：原理：其內(nèi)部同時采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴(kuò)散及凝聚等機(jī)理。功能：能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃。特點(diǎn)：內(nèi)部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長。第122頁/共139頁平板式過濾器(絲網(wǎng)分離器)

出口

過濾介質(zhì)

金屬絲網(wǎng)進(jìn)口

排污口

第123頁/共139頁五、發(fā)酵生產(chǎn)中空氣凈化的工藝流程

空氣→高空取氣管→除塵器→空氣壓縮機(jī)→貯氣罐→一級冷卻器→油水分離器→二級分離器→除霧氣→加熱器→總過濾器→分過濾器→無菌空氣（p147-148）第124頁/共139頁（一）對空氣除菌流程的要求要制備較高無菌