DB35T 1995-2021禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量 PCR 診斷技術

ICS11.220CCSB41福建省地35方標準DBT021FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitis福建省市場監(jiān)督管理局發(fā)布 前言專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、福州海關技術中心。禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR診斷技術于禽心包積液-肝炎綜合征的分子生物學診斷及流行病學監(jiān)測。范性引用文件定義液-肝炎綜合征fowlhydropercardium-hepatitissyndrome；HHSPCR應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4疫病概述V斑或出血點；腎臟腫大、質(zhì)地較脆，有的呈現(xiàn)“花斑腎”。該病主要發(fā)生于3~5周齡肉雞，10~20周齡d也可垂越早，死淘率越高。設備、材料和試劑5.1設備5.1.1臺式冷凍高速離心機(轉速應＞12000r/min)。.1.2水浴鍋或金屬浴。5.1.3微量可調(diào)移液器(量程分別為100μL~1000μL、20μL~200μL、2μL~20μL、0.5μL~10μL)。.1.5旋渦混合儀5.2材料和試劑5.2.7蛋白酶K、Tris飽和苯酚、酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、無水乙醇：直接購買成品使用。.2.11陰性對照：Nuclease-freeWater。的采集、保存和處理樣品的采集棉拭子樣品的采樣組織樣品的采集禽有明顯病變的肝臟、脾臟等組織。樣品保存樣品采集后應保存在2℃~8℃條件下，24h內(nèi)送達實驗室。超過24h的應保存在-20℃條件下，d存在-70℃~-80℃條件下。樣品的處理棉拭子樣品的處理樣品，于旋渦混合儀上振蕩15s，4℃、5000r/min離心10min，取上清液備用。組織樣品的處理取組織樣品，按質(zhì)量體積比(1:5)加入組織稀釋液進行勻漿，轉入1.5mL無菌離心管中，反復凍rminmin取上清液備用。7.1.3離心后吸取上清液轉移至1.5mL無菌離心管(注意不要吸出中間層)，加入等體積酚:氯仿:0個循環(huán)；最后保存于4℃。同時，設立陽性對照和陰性對照各至少一個。9結果判定B的B.1。tCtFAdVCt為FAdV-4核酸檢測陰性。附錄A(規(guī)范性)物序列A.1棉拭子稀釋液和制霉菌素(5000IU/mL)，調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4。A.2組織稀釋液molLPBS加青霉素(2000IU/mL)、鏈霉素(2mg/mL)、慶大霉素(50pg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)，調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4。A.575%乙醇mL的無水乙醇加入250mL的滅菌雙蒸水。PCR：PCR6bp，引物和探針用雙蒸水溶解至10μmol/L，保存于-20℃?zhèn)溆谩８戒汢(資料性)PCR和2份陰性樣品進行檢測，同時設陽性對照和陰性對N---陰性對照；品；陰性樣品；B增產(chǎn)物參考基因序列選擇FAdV-4GDMZ株(GenBank的登錄號：MG856954)Hexon基因序列作為參考基因序列：tcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactaccaacttct