流式細胞術的樣品制備

流式細胞術的樣品制備第1頁/共30頁FCM的樣品制備包括單分散細胞懸液制備技術，細胞生物學特征標記技術及熒光染色技術，FCM是對細胞或細胞器的結構和某些功能進行定量測定，并可以根據細胞亞群的特點性質對其進行分類的技術。FCM的實驗對象是單細胞或單細胞核的懸液，在FCM技術中制備出合格的單細胞懸液是非常重要的環(huán)節(jié)，這些單細胞懸液主要來源于單層細胞、血液、脫落細胞、實體組織及石蠟包埋組織等。第2頁/共30頁

一、單層培養(yǎng)細胞分散為單個細胞

㈠貼壁的單層培養(yǎng)細胞單細胞懸液的制備操作步驟：1、將單層培養(yǎng)細胞(對數生長期)中的舊培養(yǎng)液倒掉。2、加入少量0.25%胰酶，消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，立即終止消化（假如含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基），收集細胞，離心后去上清，PBS液洗滌細胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細胞懸液，用振蕩器使細胞分散。3、如果不是及時上機檢測，則需要對細胞進行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。第3頁/共30頁（二）懸浮培養(yǎng)細胞單細胞懸液的制備操作步驟：1、離心去除舊培養(yǎng)液，PBS液洗滌細胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細胞懸液，用振蕩器使細胞分散。2、如果不是及時上機檢測，則需要對細胞進行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。第4頁/共30頁

二、實體組織單分散細胞的制備

㈠新鮮實體組織新鮮實體組織是手術或活檢后根據檢測目的而采取的樣品，此樣品應及時進行適當的保存處理，如及時用固定劑或低溫對組織進行保存，以避免由于室溫過高、放置時間過長而造成組織自溶，影響檢測結果。第5頁/共30頁新鮮實體組織單細胞懸液制備方法如下：

⒈酶消化法

⒉機械法

剪碎法網搓法研磨法

⒊化學試劑處理法第6頁/共30頁⒈酶消化法酶對實體組織分散作用原理主要有三方面：

﹡一是可以破壞組織間的膠原。

﹡二是可以水解組織細胞的緊密連結裝置的蛋白性物質。

﹡三是可以水解組織間的粘多糖物質。酶消化法是實體組織分散為單細胞的主要方法，常用的酶類試劑有：

?蛋白酶類，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈蛋白酶和中性蛋白酶等)都能夠釋放所有組織中的細胞；

?胰酶，能水解脂鍵和肽鍵；

?膠原酶，能降解幾種分子類型的膠原；

?溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；

?彈性蛋白酶，能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維，可用于解離血管、心臟和肝臟的細胞。第7頁/共30頁

為使組織細胞分散下來，應用酶學方法必須注意條件的選擇和影響因素：

※

酶需要溶解于適當的溶液中，而這種溶液不致于造成酶效價降低

※

注意組織在消化液中的消化時間

※注意酶活性的PH值

※

注意酶的適用濃度

※

隨時注意影響酶活性的其他因素各種酶的分散程度都有一定的限制性，特別是在進行免疫標記實驗時，酶處理可能改變細胞膜的成分，從而影響細胞亞群的區(qū)分。應指出，用于組織分散的很多酶是不夠純的，不僅含有一種占主導的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物質，它們的活性可能有利于組織分散，也可能對組織的結構或功能產生不利的影響。第8頁/共30頁酶學方法的一般程序：①將適合于酶消化的組織置于離心管中。②將選好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織的試管中。③一般消化20-30分鐘(恒溫37oC或室溫)，消化期間要間接振蕩或吹打。④終止消化，收集細胞懸液，以尼龍網(200目)過濾，除去大團塊，以低速離心除去細胞碎片。⑤將制備好的單細胞進行流式細胞術分析或保存。第9頁/共30頁

⒉機械法機械法分裂實體組織包括：用剪刀剪碎或用鋒利的解剖刀剁碎，用勻漿器勻漿，用細注射針頭抽吸細胞以分散細胞，采用網搓法同樣也能獲得大量的細胞，機械法易造成細胞懸液中細胞碎片，所以機械法常與其他方法配合使用。第10頁/共30頁常用的幾種機械法制備過程如下：剪碎法：①將組織塊放入平皿中，加入少量的鹽水。②用剪刀將組織剪至勻漿狀。③加入10ml生理鹽水。④用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網過濾到試管中。⑤離心沉淀1000prm3-5分鐘，再用生理鹽水洗三次，每次以短時低速離心沉淀(500-800prm)去除細胞碎片。⑥以300目尼龍網過濾除去細胞團塊。⑦70%冰乙醇固定，放入4℃冰箱。

第11頁/共30頁網搓法：①將100目銅網扎在小燒杯上。②把剪碎的組織放在網上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。③用300目的尼龍網過濾細胞懸液除去大的團塊④收集細胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。

⑤70%乙醇固定，置4℃冰箱備用。第12頁/共30頁研磨法準備一只70ml組織研磨器①將組織剪碎至小塊。②放入組織研磨器中，加入1-2ml生理鹽水。③轉動研棒，研至勻漿即可。④加入生理鹽水10-20ml，沖洗研器。⑤收集細胞懸液，并經300目尼龍網過濾，離心沉淀500-800prm，1-2分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心沉淀。第13頁/共30頁

⒊化學試劑處理法

化學試劑處理法的主要原理是將細胞間起粘連作用的鈣鎂離子置換出來，從而使細胞分散下來。試劑配制：①0.2%EDTA配制

EDTA0.2g溶解后，加入Hank′s液100ml，封裝高壓消毒，置0-4℃保存。②胰酶加EDTA配制胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.2%。各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時過濾既可。第14頁/共30頁實驗步驟：①將組織切成薄片放入試管。②加入EDTA液5ml，室溫，半小時，棄之。③加入胰酶+EDTA液5-10ml，在37℃恒溫水浴30分鐘，間斷振蕩3-5次。④用300目尼龍網過濾，離心沉淀1000prm，5分鐘，再以生理鹽水洗2-3次，離心500-800prm，1-2分鐘。⑤70%乙醇固定置冰箱中被檢。第15頁/共30頁

實驗證實，用化學試劑處理組織導致細胞成活率降低，細胞產額較低，細胞碎片和細胞叢結的量不穩(wěn)定，因此，化學試劑處理方法不單獨使用，可與其他方法聯合使用。機械法常常造成嚴重的細胞損傷，較低的細胞產量，為使細胞碎片不影響FCM檢測結果，需采用適當的方法除去碎片或盡量減少碎片。酶學法對實體腫瘤的分散解聚是較理想的，但是會對所測化學成分造成不良影響，所以根據使用目的去選擇合適的單細胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣品和更好的FCM結果。第16頁/共30頁注意事項：Ⅰ新鮮組織標本應及時進行保存，以免組織在室溫下放置時間過長，造成細胞自溶導致DNA降解，影響FCM測定結果。Ⅱ根據實驗目的選用最佳的細胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結果的不穩(wěn)定。Ⅲ酶學法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。Ⅳ需注意不同的組織選用適當的方法，如富于細胞的腫瘤(淋巴瘤、視神經母細胞瘤、腦瘤、未分化癌、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤)不一定要用酶學或化學法，往往用單獨的機械法就可以收到大量單分散細胞。Ⅴ在使用酶學方法時，要重視酶的選用，如含有大量結締組織的腫瘤，如食管癌、乳癌、皮膚癌等，用膠原酶為好，因為膠原酶具有在Ca2＋、Mg2＋存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特征。第17頁/共30頁實驗方法：①石蠟包埋組織在切片機上切取40-50μm厚的組織片3-5片。②將切取的組織片放入試管中。③加入二甲苯5-8ml脫蠟(在室溫下)，1-2天，視石蠟脫凈與否，可更換一次二甲苯，蠟脫凈后棄去二甲苯。④水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10分鐘，去乙醇，加入蒸餾水3-5ml，10分鐘后棄之。⑤消化：加入2ml0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37℃恒溫水浴中消化30分鐘，消化期間每隔10分鐘振蕩一次。石蠟包埋組織單細胞懸液的制備第18頁/共30頁⑥消化30分鐘后，立即加入生理鹽水終止消化。⑦經300目尼龍網過濾，未消化完的組織片可以二次消化。⑧收集細胞懸液，離心沉淀1500prm，以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀1500prm，再以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀500-800prm，去碎片。⑨制備好的單細胞懸液作涂片，AO染色在熒光顯微鏡下觀察，應為完整細胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。⑩單細胞樣品1×106細胞/ml，加入熒光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4℃冰箱30分鐘，經300目尼龍網過濾后上機檢測。第19頁/共30頁注意事項：一定將石蠟從組織中脫干凈，檢驗是否將石蠟脫凈的方法是，棄去二甲苯，加入100%乙醇，如無絮狀物浮起，即視為石蠟已脫凈，反之則沒有脫凈。消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細胞核被消化掉。切片不可過薄或過厚，過薄則碎片增多，影響流式分析結果，過厚造成脫蠟不凈或脫蠟時間過長，一般以40-50μm為宜。第20頁/共30頁

二、血液單細胞樣品的制備血液是天然的單細胞分散細胞懸液，血中的細胞成分在生理狀態(tài)下呈分散的游離狀態(tài)，它是流式細胞分析的最合適的樣品，全血中含有紅細胞，白細胞和血小板三種有形成分，但流式細胞的檢測是以某一群細胞為測定對象，因此在檢測前須將所測的某群細胞分離出來，下面分別介紹幾種血細胞的分離制備方法。

第21頁/共30頁㈠淋巴細胞的制備⒈取肝素抗凝血2.0ml，用生理鹽水2ml將全血稀釋至4ml。⒉先將3ml人淋巴細胞分離液放入另一個離心管，然后將稀釋后的血沿試管內壁緩緩加入到分離液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)。⒊離心2000prm，30分鐘，室溫18-20℃，離心后可見試管內的血液清楚的分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層(淋巴細胞所處的位置在血漿層與分離液層中間)，底層為紅細胞，紅細胞上為粒細胞。⒋用吸管將上層與中層之間的淋巴細胞吸出，收集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至10ml，離心洗滌2次，每次均以1500prm,10分鐘，棄上清后即得到純度較高的淋巴細胞，但可有少量的單核細胞。⒌70%冰乙醇固定，置4℃冰箱保存。第22頁/共30頁㈡粒細胞的制備⒈用淋巴細胞分離液對細胞進行分層。⒉粒細胞的比重較淋巴細胞稍大，因此經分離液分離后的粒細胞，分層于紅細胞之上，分離液的底部。⒊以吸管慢慢將粒細胞層吸出，置另一支離心管內，以5ml的Hank′s液洗滌三次，每次離心沉淀1500prm，10分鐘。⒋在吸取粒細胞的同時常附帶一些紅細胞，因此需將紅細胞去除，加入1.0ml低滲溶液，30-40秒。⒌再以Hank′s液洗滌2次，即可獲得純度大于95%以上的粒細胞。第23頁/共30頁㈢單核細胞制備1.取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理鹽水將血稀釋,均在無菌條件下操作。2.1640培養(yǎng)液10.0ml,放入培養(yǎng)瓶內,將稀釋血加入培養(yǎng)液中,混勻,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。3.放入37℃恒溫箱內孵育30-40分鐘,取出培養(yǎng)瓶,將血傾倒掉,用生理鹽水將培養(yǎng)瓶輕輕沖洗一次,以去掉殘留的血液,這時培養(yǎng)瓶壁上貼附了大量的單核細胞,因為單核細胞具有短時培養(yǎng)期內貼附快的特點

,而其他細胞沒有這個特性,所以利用這一特性進行短時培養(yǎng)可獲得較純的單核細胞。第24頁/共30頁4.將粘附于培養(yǎng)瓶壁上的單核細胞消化下來,用0.25%胰酶消化10－15分鐘,室溫下,并不斷搖震,以促使細胞脫落下,單核細胞的粘附力很強,用酶消化往往獲得細胞數少,目前亦采用機械的方法,用一橡皮刷,伸入培養(yǎng)瓶在瓶壁上輕擦,將細胞刮取下,但切勿用力過大,造成細胞損傷過多。5.脫落下來的細胞移入離心管,離心沉淀1500prm,5分鐘,再以生理鹽水漂洗2－3次,每次離心800prm,2分鐘,以去除碎片雜質。6.將細胞涂片,以丫啶橙染色,置熒光顯微鏡下觀察形態(tài)和純度。7.將細胞以70%乙醇固定,置0-4℃冰箱保存?zhèn)錂z。第25頁/共30頁第26頁/共30頁三、脫落細胞單細胞懸液的制備在臨床實際工作中，可收集到大量自然脫落的細胞，這些細胞標本經過簡單的處理，就可得到較好的單分散細胞懸液，所以是流式細胞術檢測的天然樣品，下面介紹幾種常見的脫落細胞樣品制備方法。㈠宮頸脫落細胞懸液的制備1.首先用生理鹽水沖洗宮頸表面的分泌物,以海棉輕拭宮頸表