流式細胞儀的原理

流式細胞儀的原理第1頁/共50頁流式細胞術(shù)的原理及應(yīng)用第2頁/共50頁流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段，能夠快速、精確的對單個細胞或顆粒的物理和化學(xué)特性（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。第3頁/共50頁流式細胞術(shù)的特點（1）流式細胞術(shù)最大的特點是能在保持細胞及細胞器的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。（2）測量快速、大量、準確、靈敏、定量第4頁/共50頁流式細胞儀的檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒度DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細胞功能?

細胞表面/胞漿/核的特異性抗原?

細胞活性?

細胞內(nèi)/外的細胞因子?

激素結(jié)合位點?

細胞受體?

鈣離子濃度?

線粒體膜電位?

……第5頁/共50頁一、流式細胞儀的工作原理采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。第6頁/共50頁1.流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第7頁/共50頁（1）液流系統(tǒng)

單細胞懸液大多數(shù)儀器檢測范圍是在50-300μm大小。將細胞懸液注射進入鞘液中這一過程,稱為流體動力學(xué)聚焦第8頁/共50頁液流系統(tǒng)示意圖第9頁/共50頁（2）光學(xué)系統(tǒng)

由激光光源、分色反光鏡、光束成形器、透鏡組、濾片和光電倍增管組成。FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector第10頁/共50頁流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別區(qū)別流式細胞儀光學(xué)顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學(xué)信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計計算機人工結(jié)果多參數(shù)，高通量綜合分析簡單，單參數(shù)第11頁/共50頁二、散射光的測量

細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。第12頁/共50頁前向散射光（FS）

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。

通常在FCM應(yīng)用中，選取FS作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。第13頁/共50頁前向散射光示意圖FALSSensorLaser第14頁/共50頁前向散射光第15頁/共50頁側(cè)向散射光（SS）

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。第16頁/共50頁側(cè)向散射光示意圖FALSSensor90LSSensorLaser第17頁/共50頁側(cè)向散射光第18頁/共50頁

光散射測量的用途

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第19頁/共50頁三、熒光的測量熒光信號由被檢細胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。第20頁/共50頁熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)第21頁/共50頁熒光信號的檢測使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量第22頁/共50頁第23頁/共50頁熒光補償?shù)?4頁/共50頁5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7第25頁/共50頁四、細胞分選原理

通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。第26頁/共50頁細胞分選示意圖細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電第27頁/共50頁第28頁/共50頁五、數(shù)據(jù)的顯示與分析參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設(shè)門分析技術(shù)第29頁/共50頁（一）參數(shù)說明FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少以及熒光種類第30頁/共50頁（二）數(shù)據(jù)顯示方式直分析方圖單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖二維等高圖假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析第31頁/共50頁1.單參數(shù)直方圖

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。第32頁/共50頁單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量信道(channel)第33頁/共50頁2.雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。第34頁/共50頁雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度第35頁/共50頁（三）設(shè)門分析技術(shù)1.Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。第36頁/共50頁A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門第37頁/共50頁線性門第38頁/共50頁

2.

區(qū)閾（Region設(shè)置）:

如十字門分析時，由四個區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+第39頁/共50頁（1）淋巴細胞亞群檢測：CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19

免疫功能的變化監(jiān)測，AIDS（2）HLA-B27:強直性脊柱炎

（3）白血病免疫分型：白血病的分類（4）貧血的鑒定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗體

(5)………..

六、流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用第40頁/共50頁七、流式細胞儀的科研應(yīng)用細胞周期的分析干細胞研究癌癥病人的多藥耐藥性細胞動力學(xué)功能研究環(huán)境微生物分析流式細胞術(shù)與分子生物學(xué)研究流式細胞術(shù)在免疫檢驗中的應(yīng)用第41頁/共50頁DNA細胞周期分析ScelldivisionG1(DNAsynthesis)G2M(mitosis)第42頁/共50頁第43頁/共50頁PI染色檢測細胞周期Protocol

離心收集細胞，棄上清，用PBS洗細胞兩次。加入預(yù)冷的70%乙醇，于40C固定過夜，或-200C長期固定。細胞染色：離心收集細胞，用1mlPBS洗細胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙錠（PI），100ug/mlRNaseA,0.2%TritonX-100)40C避光孵育30分鐘。流式細胞儀檢測：一般細胞計數(shù)2-3萬個。結(jié)果用軟件Modfit分析。第44頁/共50頁第45頁/共50頁

細胞凋亡的檢測細胞形態(tài)及細胞膜通透性的變化(Hoechest33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）Caspases激活(Caspase-3)

線粒體跨膜電位降低(Rhodamine123）膜磷脂酰絲氨酸外化(AnnexinV-FITC/PI)Ca2+濃度升高(Fluo-3）DNA斷裂及含量的變化(TUNEL和PI）第46頁/共50頁

Annexin-V和PI雙染protocol

細胞用冷PBS洗滌二次并在恰當(dāng)?shù)娜旧彌_液（bindingbuffer）中以1x106

細胞/mL的濃度重懸吸取100ul的細胞(1x105)至試管中。加進適量的熒光標(biāo)記的annexin-V試劑和PI?；靹蚝蟊芄馐覝叵路跤?5分鐘。（必須在室溫下進行）孵育后加進400ul染色緩沖液，立即上流式細胞儀分析。第47頁