現(xiàn)代生物技術(shù)酶工程

現(xiàn)代生物技術(shù)酶工程第1頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日酶工程概述1酶的生產(chǎn)與分離純化2

酶反應(yīng)器和酶?jìng)鞲衅?第五章酶工程

化學(xué)修飾酶與化學(xué)人工酶3固定化酶4第2頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日第一節(jié)酶工程的概述酶工程（enzymeengineering)又稱酶技術(shù)，是指利用酶催化的作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品的過程，它是酶學(xué)理論與化學(xué)技術(shù)相結(jié)合而形成的一門新技術(shù)。酶工程是生物工程的重要組成部分，它與基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程相互依存、相互促進(jìn)，它們?cè)谏锕こ痰难芯?、開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化過程中要靠彼此合作來實(shí)現(xiàn)。第3頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日酶工程與發(fā)酵工程、基因工程、細(xì)胞工程的關(guān)系基因工程基因工程菌發(fā)酵工程酶酶工程細(xì)胞工程酶轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物菌體細(xì)胞固定化菌體細(xì)胞細(xì)胞第4頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

一、酶工程的內(nèi)容1.酶工程的分類：（1）化學(xué)酶工程：自然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶、化學(xué)人工酶的研究和應(yīng)用。（2）生物工程酶：①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）；②修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）；③設(shè)計(jì)新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。第5頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.酶工程的內(nèi)容（1）酶的產(chǎn)生

酶制劑的來源，有微生物、動(dòng)物和植物，但是，主要的來源是微生物。由于微生物比動(dòng)植物具有更多的優(yōu)點(diǎn)，因此，一般選用優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株，通過發(fā)酵來產(chǎn)生酶。為了提高發(fā)酵液中的酶濃度，選育優(yōu)良菌株、研制基因工程菌、優(yōu)化發(fā)酵條件。工業(yè)生產(chǎn)需要特殊性能的新型酶，如耐高溫的α—淀粉酶、耐堿性的蛋白酶和脂肪酶等，因此，需要研究、開發(fā)生產(chǎn)特殊性能新型酶的菌株。第6頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

（2）酶的制備

酶的分離提純技術(shù)是當(dāng)前生物技術(shù)“后處理工藝”的核心。采用各種分離提純技術(shù)，從微生物細(xì)胞及其發(fā)酵液，或動(dòng)、植物細(xì)胞及其培養(yǎng)液中分離提純酶，制成高活性的不同純度的酶制劑，為了使酶制劑更廣泛地應(yīng)用于國民經(jīng)濟(jì)各個(gè)方面，必須提高酶制劑的活性、純度和收率，需要研究新的分離提純技術(shù)。第7頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（3）酶和細(xì)胞固定化

酶和細(xì)胞固定化研究是酶工程的中心任務(wù)。為了提高酶的穩(wěn)定性，重復(fù)使用酶制劑，擴(kuò)大酶制劑的應(yīng)用范圍，采用各種固定化方法對(duì)酶進(jìn)行固定化，制備了固定化酶，如固定化葡萄糖異構(gòu)酶、固定化氨基?；傅龋瑴y(cè)定固定化酶的各種性質(zhì)，并對(duì)固定化酶作各方面的應(yīng)用與開發(fā)研究。目前固定化酶仍具有強(qiáng)大的生命力。它受到生物化學(xué)、化學(xué)工程、微生物、高分子、醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域的高度重視。第8頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（3）酶和細(xì)胞固定化固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)發(fā)發(fā)展起來的。用各種固定化方法對(duì)微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞進(jìn)行固定化，制成各種固定化生物細(xì)胞.研究固定化細(xì)胞的酶學(xué)性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，研究與開發(fā)固定化細(xì)胞在各方面的應(yīng)用，是當(dāng)今酶工程的一個(gè)熱門課題。固定化技術(shù)是酶技術(shù)現(xiàn)代化的一個(gè)重要里程碑，是克服天然酶在工業(yè)應(yīng)用方面的不足之處，而又發(fā)揮酶反應(yīng)特點(diǎn)的突破性技術(shù)?？梢哉f沒有固定化技術(shù)的開發(fā)，就沒有現(xiàn)代的酶技術(shù)。第9頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（4）酶分子改造

又稱為酶分子修飾。為了提高酶的穩(wěn)定性，降低抗原性，延長(zhǎng)藥用菌在機(jī)體內(nèi)的半衰期，采用各種修飾方法對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以便創(chuàng)造出天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性(如較高的穩(wěn)定性、無抗原性、抗蛋白酶水解等)，甚至于創(chuàng)造出新的酶活性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用，從而提高酶的應(yīng)用價(jià)值，達(dá)到較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。第10頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（4）酶分子改造

酶分子改造可以從兩個(gè)方面進(jìn)行：

(1)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行改造，期望獲得一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)較為合理的具有優(yōu)良特性、高活性的新酶(突變酶)。(2)用化學(xué)法或酶法改造酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，或者用化學(xué)修飾法對(duì)酶分子中側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾．以便改變酶學(xué)性質(zhì)。這類酶在酶學(xué)基礎(chǔ)研究上和醫(yī)藥上特別有用。第11頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

（5）有機(jī)介質(zhì)中的酶反應(yīng)由于酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化反應(yīng)具有許多優(yōu)點(diǎn)。因此，近年來，酶在有機(jī)介質(zhì)中催化反應(yīng)的研究，已受到不少人的重視，成為酶工程中一個(gè)新的發(fā)展方向。酶在有機(jī)介質(zhì)中要呈現(xiàn)很高的活性，必須具備哪些條件?有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶的性質(zhì)有哪些影響?如何影響?近年來，對(duì)這些問題的研究，已取得重要進(jìn)展。第12頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（6）酶?jìng)鞲衅?/p>

又稱為酶電極。酶電極是由感受器(如固定化酶)和換能器(如離子選擇性電極)所組成的一種分析裝置，用于測(cè)定混合物溶液中某種物質(zhì)的濃度，其研究?jī)?nèi)容包括：酶電極的種類、結(jié)構(gòu)與原理；酶電極的制備、性質(zhì)及應(yīng)用。第13頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（7）酶反應(yīng)器酶反應(yīng)器是完成酶促反應(yīng)的裝置。其研究?jī)?nèi)容包括：酶反應(yīng)器的類型及特性；酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、制造及選擇等。第14頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（8）抗體酶、人工酶和模擬酶

抗體酶是一類具有催化活性的抗體。是抗體的高度專一性與酶的高效催化能力二者巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。其研究?jī)?nèi)容是：抗體酶的制備、結(jié)構(gòu)、特性、作用機(jī)理、催化反應(yīng)類型、應(yīng)用等。人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白質(zhì)。據(jù)1977年Dhar等人報(bào)道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性為天然溶菌酶的50%。利用有機(jī)化學(xué)合成的方法合成了—

些比酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單得多的具有催化功能的非蛋白質(zhì)分子。這些物質(zhì)分子可以模擬酶對(duì)底物的結(jié)合和催化過程。既可以達(dá)到酶催化的高效率，又能夠克服酶的不穩(wěn)定性。這樣的物質(zhì)稱為模擬酶。用環(huán)糊精已成功地模擬了胰凝乳蛋白酶等多種酶。第15頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（9）酶技術(shù)的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、食品、發(fā)酵、紡織、制革、化學(xué)分析、氨基酸合成、有機(jī)酸合成、半合成抗生素合成、能源開發(fā)以及環(huán)境工程等方面的應(yīng)用都很廣泛。①運(yùn)用酶技術(shù)生產(chǎn)有重要價(jià)值的產(chǎn)品。②利用酶制劑改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。第16頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日二、酶工程的意義、發(fā)展及展望1.酶工程的研究意義一切生物的生命活動(dòng)都是由新陳代謝的正常運(yùn)轉(zhuǎn)來維持的，而代謝中的各種化學(xué)反應(yīng)是由各種酶的催化來實(shí)現(xiàn)的。沒有酶，代謝就會(huì)停止，生命亦就停止。個(gè)別酶的缺乏或者酶活性受到抑制就會(huì)使代謝受阻或紊亂，從而引起疾病。因此，研究酶的結(jié)構(gòu)與功能以及動(dòng)力學(xué)，對(duì)于闡明生命的本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律，對(duì)于闡明發(fā)病機(jī)理以及診斷治療，具有極其重要的作用。由于酶是生物催化劑，與化學(xué)催化劑相比．既有共性，又有個(gè)性。因此，對(duì)酶的研究成果必然能充實(shí)，發(fā)展催化劑理論，而且，還能為催化劑設(shè)計(jì)、藥物設(shè)計(jì)、疾病的診斷治療，提供重要的依據(jù)和新思想、新概念。第17頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.酶工程的研究意義有些酶是蛋白質(zhì)和核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定和基因工程研究的重要工具。例如：胰蛋白酶羧肽酶，脂肪酶等作為測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的工具酶；限制性內(nèi)切酶、T7DNA聚合酶、核糖核酸酶、核酸酶等作為測(cè)定核酸一圾結(jié)構(gòu)的工具酶：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶，TaqDNA聚合酶等作為基因工程的工具酶。由此可見，工具酶是研究分子生物學(xué)的重要手段之一。它在一定程度上推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。酶技術(shù)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已有日益廣泛的應(yīng)用，產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。第18頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.酶工程的研究進(jìn)展

兩個(gè)方向：酶的應(yīng)用研究、酶技術(shù)研究；酶的理論研究。

（1）酶的應(yīng)用研究進(jìn)展1926年，索姆奈(Sumner)首次從刀豆中制備出脲酶結(jié)晶，并提出，酶是具有催化能力的蛋白質(zhì)。從此以后．人們開展了各種酶的分離提純的研究，制備了各種不同規(guī)格的酶制劑。從20世紀(jì)“50年代起，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的酶制劑品種愈來愈多?，F(xiàn)在，α—淀粉酶、糖化酶、葡萄搪異構(gòu)酶、果膠酶、凝乳酶、乳糖酶、脂肪酶、各種蛋白酶等，已經(jīng)實(shí)用化、商品化。上述酶制劑在食品加工，發(fā)酵上業(yè)，制革工業(yè)，紡織工業(yè)，氨基酸、有機(jī)酸和半合成抗生素的合成工業(yè)，醫(yī)療衛(wèi)生，能源開發(fā)以及環(huán)境工程中、有日益廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮了重要的作用。第19頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日酶工程是在人類原始的應(yīng)用酶的催化作用的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的。二十世紀(jì)以來，特別是二十世紀(jì)五十年代以來，酶的應(yīng)用技術(shù)有了很大的進(jìn)步。五十年代酶制劑的生產(chǎn)有了迅速發(fā)展，這一時(shí)期主要是溶液酶的應(yīng)用；六十年代出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)，六十年代來已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；七十年代出現(xiàn)了固定化細(xì)胞的技術(shù)，至目前又發(fā)展了固定化增增細(xì)胞的研究，亦發(fā)展了包括輔助因子再生的固定化多酶反應(yīng)體系的研究。人類原始應(yīng)用酶的催化作用可謂源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。我國勞動(dòng)人民在四千年前已掌握了釀酒技術(shù)，商朝的釀酒業(yè)已相當(dāng)發(fā)達(dá)，秦漢前已將麥芽用于制造飴糖等等。但是直到十九世紀(jì)人們才逐漸建立起“酶”的概念。1908年羅門等利用胰酶鞣制皮革，1917年法國人博伊丁和埃芬特用枯草桿菌產(chǎn)生的淀粉酶用作紡織工業(yè)上的退漿劑。此后酶在工業(yè)上應(yīng)用的研究逐漸深入到很多工業(yè)部門。到了1949年，由于日本采用深層培養(yǎng)法生產(chǎn)細(xì)菌α—淀粉酶獲得成功，才使酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用進(jìn)入工業(yè)化的階段。第20頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日從此，蛋白酶、果膠酶、轉(zhuǎn)化酶等相繼投入市場(chǎng)。1959年由于采用葡萄糖淀粉酶催化淀粉生產(chǎn)葡聚糖的新工藝研究成功．徹底革除了原來葡萄糖生產(chǎn)中需要高溫高壓的酸水解工藝，使淀粉得糖率由80%提高到l00％，致使日本1960年的精制葡萄糖產(chǎn)量猛增10倍。由于這項(xiàng)改革的成功，大大促進(jìn)了酶在工業(yè)上應(yīng)用的發(fā)展，先后出現(xiàn)了不少成功的應(yīng)用實(shí)例。如5’-磷酸二酯酶用于5’-核苷酸的生產(chǎn)，用青霉素酰胺酶制備6-氨基青霉烷酸(6-APA)，氨基酰化酶拆分DL-氨基酸，9-酪氨酸酶催化生產(chǎn)L-多巴等等。五十年代，盡管酶的應(yīng)用有很大發(fā)展，但與酶學(xué)研究的進(jìn)展相比，其發(fā)展還是緩慢的，主要原因是酶的生產(chǎn)和應(yīng)用技術(shù)落后。由于酶的分離純化比較復(fù)雜，分離的酶穩(wěn)定性顯著下降，并且采用在水溶液中分批反應(yīng)，反應(yīng)后的酶很難回收，致使成本很高，阻得了酶應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。第21頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日從應(yīng)用的目的出發(fā)，Crubhofer和Schleith從1953年開始研究酶的固定化。他們將胃蛋白酶、淀粉酶、羧肽酶和核糖核酸酶等結(jié)合在重氮化的樹脂上，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化。1969年，日本千佃一郎首次應(yīng)用固定化氨基?；复笠?guī)模生產(chǎn)L-氨基酸。從此以后．固定化酶研究十分活躍，進(jìn)展很快?，F(xiàn)在、已有十多種固定化酶用于工業(yè)生產(chǎn)。例如：利用固定化葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果葡萄漿；利用固定化青霉素?；干a(chǎn)6-氨基青霉烷酸；利用固定化乳糖酶生產(chǎn)低乳糖牛奶等。但是，大多數(shù)固定化酶的應(yīng)用研究，仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段或中試生產(chǎn)階段，要用于工業(yè)生產(chǎn)上有待進(jìn)一步研究。為了減少從微生物細(xì)胞中分離提純酶的麻煩，或者有目的地利用微生物細(xì)胞內(nèi)的復(fù)合酶系統(tǒng)，從70年代初起，人們直接對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行固定化研究.1973年，干佃一郎首次利用固定化大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)L-天冬氨酸。從此以后，微生物細(xì)胞固定化研究十分活躍，進(jìn)展很快?，F(xiàn)在，已有愈來愈多的固定化微生物細(xì)胞用于工業(yè)生產(chǎn)。例如：固定化大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸；固定化產(chǎn)氨短桿菌細(xì)胞生產(chǎn)L—蘋果酸；固定化假單孢菌細(xì)胞生產(chǎn)L-丙氨酸；固定化鏈霉菌細(xì)胞生產(chǎn)果葡糖漿；固定化釀酒酵母細(xì)胞生產(chǎn)酒精等。但是，大多數(shù)固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用研究，尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段或小試生產(chǎn)階段，向待進(jìn)一少研究。第22頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日因?yàn)楣潭ɑ?xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、化學(xué)合成困難的化合物的生產(chǎn)特別有用，所以近年來已成為酶工程研究中引人注目的領(lǐng)域。并且用固定化細(xì)胞己進(jìn)行了不少有用化合物的試生產(chǎn)，包括有機(jī)酸、氨基酸、抗生素和輔酶等。例如固定化產(chǎn)氨短桿菌可以通過五步酶反應(yīng)連續(xù)合成輔酶A。1983年在英國倫敦召開的生物工程會(huì)議上，日本人小田等介紹了用海藻酸鈣和光交聯(lián)樹脂兩種方法固定化酵母的增殖細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)酒精的研究報(bào)告，他們?cè)谠囼?yàn)工廠中用4千升的流動(dòng)柱床反應(yīng)器，以甘蔗糖蜜生產(chǎn)酒精，在柱反應(yīng)器流出液中酒精濃度可達(dá)到8.5—9.0％，每千升的反應(yīng)器每天能生產(chǎn)純酒精600升．酒精的轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論值的95％，生產(chǎn)能力超過常規(guī)分批式發(fā)酵工藝的20倍。用海藻酸鈣包埋的酵母工作穩(wěn)定性達(dá)4個(gè)月以上，用光交聯(lián)樹脂固定的酵母細(xì)胞工作穩(wěn)定性達(dá)2年以上。固定化增殖酵母細(xì)胞用于連續(xù)化生產(chǎn)酒精的工藝目前己由實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)到實(shí)驗(yàn)工廠，看來實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)是很有希望的。固定化增殖細(xì)胞用于處理廢水現(xiàn)在已經(jīng)達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的水平。第23頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日微生物細(xì)胞固定化研究，已從利用—種酶反應(yīng)的固定化死菌體，發(fā)展到利用多酶反應(yīng)的固定化活菌體，從固定化休眠菌體、饑餓菌體發(fā)展到固定化增殖茵體。最近，還發(fā)展到固定化基因工程菌。從80年代起，人們開始把目光放到動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞固定化上。動(dòng)物和植物細(xì)胞固定化，雖然比微生物細(xì)胞固d定化難得多，但是，它們能產(chǎn)生微生物難以產(chǎn)生的貴重藥物，如：乙肝病毒表面抗原、單克隆抗體、人參皂苷等，目前，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的固定化研究，尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段或中試階段，需要深入研究。50年代末到60年代，人們致力于用小分子化合物修改酶分子中的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)，以研究一些酶活性基團(tuán)的情況，得到了很有價(jià)值的數(shù)據(jù)。第24頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日較早用大分子物質(zhì)修飾酶的是Katchalsko等人。他們用DEAE—右旋糖酐、多肽等修飾了酶，使酶的性質(zhì)得到了改善。從70年代開始．隨著研究的普遍進(jìn)展，在修飾劑的選用、修飾方法上，都有新的發(fā)展。現(xiàn)在，有一些酶(如L-天門冬酰胺酶等)用大分子修飾劑修飾之后，其熱穩(wěn)定性提高，抗失活因子能力加強(qiáng)，抗原性消除，體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)。由此可見，酶化學(xué)修飾在一定程度上可以克服天然酶的缺點(diǎn)，使其更適合于工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療上的需要。近年來，人們對(duì)抗體酶、人工酶、模擬酶等；進(jìn)行了研究，取得了一些進(jìn)展，今后將進(jìn)一步研究。隨著固定化酶(或細(xì)胞)的研究進(jìn)展，人們研究、設(shè)計(jì)、制造了各種各樣的固定化酶反應(yīng)器.其中，有一些巳應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前．固定化酶反應(yīng)器的應(yīng)用，尚處于開發(fā)的早期階段。其最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)的最佳控制。第二代新型的固定化酶反應(yīng)器，例如：能實(shí)現(xiàn)輔因子(輔酶Ⅰ和ATP等)再生的酶反應(yīng)器、兩相或多相酶反應(yīng)器、組合酶反應(yīng)器等，正在研制之中。第25頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日自從1967年酶電極問世以來，酶電極的研究引起了不少人的極大興趣?，F(xiàn)在，不少酶電極已經(jīng)實(shí)用化、商品化，用于測(cè)定混合物溶液中某種物質(zhì)的濃度。例如：用葡萄糖氧化酶電極測(cè)定血液、尿、發(fā)酵液中的葡萄糖濃度；用脲酶電極測(cè)定血液中的尿素濃度。酶電極在臨床化驗(yàn)、發(fā)酵生產(chǎn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及其他化學(xué)分析等方面，展示了廣闊的前景。近年來，人們正在研制各種新型的酶電極，如多功能酶電極、微型酶電極、抗干擾酶電極等。酶標(biāo)免疫分析是60年代發(fā)展起來的新的免疫測(cè)定技術(shù)。酶標(biāo)免疫分析是以待測(cè)抗原(或抗體)與酶標(biāo)抗體(或抗原)的專一性反應(yīng)為基礎(chǔ)，然后通過酶活力測(cè)定，來確定抗原(或抗體)含量的—類分析法?，F(xiàn)在，已建立了各種酶標(biāo)免疫分析法，用于測(cè)定血液中抗原或抗體的含量，有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度。第26頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（2）酶的理論研究進(jìn)展(1)新酶的發(fā)現(xiàn)和鑒定

迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的酶有25000多種，數(shù)千種酶被鑒定，并達(dá)到不同的純度，數(shù)百種酶得到了結(jié)晶，數(shù)百種酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)出來。每年都有新酶被發(fā)現(xiàn)；每年都有不少酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)出。(2)酶一級(jí)結(jié)構(gòu)與活力的關(guān)系

過去主要用化學(xué)修飾的方法研究酶一級(jí)結(jié)構(gòu)與活力的關(guān)系，獲得了不少的信息。近年來，除了繼續(xù)用上述技術(shù)以外，還采用下列新技術(shù)對(duì)此問題作更深入的研究：①過渡態(tài)類似物技術(shù)②自殺性底物技術(shù)。③基因定位突變技術(shù)④計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)等。(3)酶分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定一部分酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被測(cè)出來，但是，還有大多數(shù)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)尚待測(cè)定。第27頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日對(duì)酶分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，x-射線晶體結(jié)構(gòu)分析法仍然是十分有效的方法。近年來，二維核磁共振技術(shù)的應(yīng)用愈來愈廣。后者可以測(cè)定溶液中酶分子構(gòu)象及其變化過程。運(yùn)用上述兩種技術(shù)必將測(cè)出更多的酶分子構(gòu)象。

(4)酶活性部位結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理的研究這是酶學(xué)研究的核心的問題。近年來，運(yùn)用下列新技術(shù)研究酶活性部位結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理，取得了重大的進(jìn)展.

①應(yīng)用x-射線晶體結(jié)構(gòu)分析技術(shù)研究酶一底物(或底物類似物)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，可以確定酶活性部位結(jié)構(gòu)以及酶分子與底物分子的結(jié)合情況。②應(yīng)用二維核磁共振技術(shù)可以確定酶活性部位上解離基團(tuán)的pK值以及催化過程中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移情況.③關(guān)于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，現(xiàn)在已用電子計(jì)算機(jī)編程序，對(duì)酶與底物的作用方式以及底物反應(yīng)過程中可能存在的酶分子形式，作出判斷。

④應(yīng)用隧道電鏡技術(shù)可以觀察到酶催化過程中質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移的情況。第28頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日（3）我國固定化酶技術(shù)的發(fā)展和取得的成績(jī)我國從事固定化酶的研究開始于1970年。中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所及微生物研究所相繼把染料工業(yè)中使用的雙功能試劑對(duì)-硫酸酯乙砜基苯胺引入固定化酶領(lǐng)域，它與多糖如甘蔗渣纖維、交聯(lián)瓊脂、葡聚糖凝膠等反應(yīng)，得到各種帶有苯胺基的載體，然后在十分溫和的條件下與酶共價(jià)偶聯(lián)。1972年，上海生物化學(xué)研究所用這類載體ABSE(對(duì)氨基苯磺酰乙基)-葡聚糖凝膠共價(jià)結(jié)合紅酵母的3’-核糖核酸酶，生產(chǎn)3’-核苷酸試劑。我國科研工作者還用這類載體共價(jià)結(jié)合了多種酶。這些固定化酶都得到滿意的結(jié)果，發(fā)展成為頗具我國特點(diǎn)的固定化方法。1977年底，上海生物化學(xué)研究所與江門甘蔗化工廠、上海啤酒廠協(xié)作將固定化5’-磷酸二酯酶用于5’-核苷酸的生產(chǎn)，這使世界上工業(yè)上實(shí)用的固定化酶又增添了新的一員。中國科學(xué)院微生物所用固定化多核苷酸磷酸化酶穩(wěn)定地用于制備多聚核苷酸，已在1978年下半年進(jìn)行了鑒定。第29頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日我國對(duì)固定化細(xì)胞的應(yīng)用也進(jìn)行了不少工作。上海生物化學(xué)研究所，上海第三制藥廠和上海醫(yī)藥工業(yè)研究院用明膠戊二醛使具有青霉素酰胺酶活力的菌體固定化裝柱連續(xù)生產(chǎn)6—氨基青霉烷酸7個(gè)月，活力幾乎不變，達(dá)到世界先進(jìn)水平。中國科學(xué)院微生物研究所與太原制藥廠協(xié)作也成功地用瓊脂、戊二醛包埋大腸桿菌用于工業(yè)生產(chǎn)6—氨基青霉烷酸．1978年12月化工部醫(yī)藥局對(duì)這二項(xiàng)工藝通過了鑒定。中國科學(xué)院微生物所于1977年和1979年分別用固定化菌體生產(chǎn)天門冬氨酸和蘋果酸獲得成功。近幾年，不少單位采用固定化細(xì)胞和固定化酶生產(chǎn)高果糖漿的研究取得重要進(jìn)展，準(zhǔn)備工業(yè)生產(chǎn)。近年來，我國在輔酶的固定化、固定化酶在醫(yī)療和人工器官上的應(yīng)用做了不少探索。固定化酶在分析及親和層析方面的應(yīng)用也取得了一些進(jìn)展。如華北制藥廠用固定化青霉素酶對(duì)青霉素效價(jià)的測(cè)定；上海生物化學(xué)研究所用固定化5’磷酸二酯酶和固定化堿性磷酸單酯酶進(jìn)行寡核苷酸序列分析；北京大學(xué)曾試用固定化酶提純胰蛋白酶抑制劑等等。第30頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日第二節(jié)食品酶的生產(chǎn)與分離純化第31頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日酶的生產(chǎn)酶的提取酶的分離純化制成酶制劑后直接利用制成固定化酶（或固定化細(xì)胞）后利用用于治療疾病用于加工和生產(chǎn)一些產(chǎn)品用于化驗(yàn)診斷和水質(zhì)臨界測(cè)定用于生物技術(shù)其他分支領(lǐng)域酶制劑的利用酶制劑的生產(chǎn)第32頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

一、酶的生產(chǎn)酶的生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，并且通過人工控制而獲得所需要的酶的過程。3種方法：提取法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法。最常用的是微生物發(fā)酵法。第33頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.微生物發(fā)酵生產(chǎn)法的優(yōu)點(diǎn)

①微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全。②微生物生長(zhǎng)繁殖快，生活周期短，酶的產(chǎn)量高。③微生物培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)原料來源豐富，價(jià)格低廉，機(jī)械化程度高，經(jīng)濟(jì)效益高。④微生物有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變及基因工程等方法培育出新的產(chǎn)酶菌種。第34頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.微生物發(fā)酵法制酶對(duì)生產(chǎn)菌的要求

①安全可靠，非致病菌，不會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)。②產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化，不易感染噬菌體。③繁殖快，產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶。④能利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)。⑤產(chǎn)生的酶容易分離純化。第35頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日3.發(fā)酵方法與發(fā)酵條件

（1）發(fā)酵方法①固體發(fā)酵法：以麩皮、米糠等為基本原料，加無機(jī)鹽和適量水分（通常50%左右）進(jìn)行的微生物培養(yǎng)。方法：淺盤法（培養(yǎng)基不超過5cm）轉(zhuǎn)鼓法（培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)翻動(dòng)）通氣式厚發(fā)酵（培養(yǎng)基可達(dá)20～30mm）第36頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日3.發(fā)酵方法與發(fā)酵條件

②液體發(fā)酵法：利用合成的液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)的發(fā)酵方法。方法：間歇發(fā)酵法連續(xù)發(fā)酵法第37頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日3.發(fā)酵方法與發(fā)酵條件（2）發(fā)酵條件的控制

發(fā)酵條件既要有利菌體生長(zhǎng)繁殖，又不影響酶的形成。一般處理是先確定菌體生長(zhǎng)的最適條件，然后作出調(diào)整以滿足酶生成的需要。首先，培養(yǎng)基組成對(duì)菌的生長(zhǎng)和酶的合成具有最直接的影響。其次，通風(fēng)量、培養(yǎng)溫度等因素不僅影響菌體生長(zhǎng)，也影響酶的合成。一般來說在低于生長(zhǎng)溫度下產(chǎn)酶量高。培養(yǎng)溫度還影響酶活力的穩(wěn)定性。另外，在生產(chǎn)中掌握適宜酶的回收期時(shí)也很重要，對(duì)于大多數(shù)胞外酶來說，酶合成與菌株生長(zhǎng)大致平行，生長(zhǎng)停止時(shí)酶產(chǎn)量達(dá)最大，再培養(yǎng)酶產(chǎn)量多要下降。第38頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日4.產(chǎn)酶常用的微生物（1）細(xì)菌：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等（2）放線菌：鏈霉菌（3）霉菌：黑曲霉、米曲霉、紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等（4）酵母：啤酒酵母、假絲酵母第39頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日5.微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)：

在人工控制的條件下，有目的利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需的酶。包括：培養(yǎng)基，發(fā)酵方式的選擇，發(fā)酵條件的控制管理等。第40頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

（1）培養(yǎng)基①碳源②氮源③無機(jī)鹽類④生長(zhǎng)因子⑤pH第41頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

（2）酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式①固體發(fā)酵：用于真菌的酶生產(chǎn)，如米曲霉生產(chǎn)淀粉酶，曲霉和毛霉生產(chǎn)蛋白酶。②液體深層發(fā)酵：控制發(fā)酵條件溫度、通氣和攪拌、pH等發(fā)酵條件。第42頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

（3）提高酶產(chǎn)量的措施①選育優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株②添加誘導(dǎo)物：酶的作用底物，酶的反應(yīng)產(chǎn)物，酶的底物類似物。③降低阻遏物濃度④表面活性劑⑤添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑第43頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

二、酶的分離純化酶的分離純化：是指從微生物的發(fā)酵液或動(dòng)植物組織提取液及細(xì)胞培養(yǎng)液中得到不同純度、高質(zhì)量的酶產(chǎn)品。酶分離純化的方法是根據(jù)酶的蛋白質(zhì)特性而建立的。第44頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日酶的分離純化細(xì)胞破碎酶的提取離心分離過濾與膜分離層析分離電泳分離萃取分離濃縮干燥結(jié)晶第45頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1、細(xì)胞破碎除胞外酶之外，絕大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞內(nèi)部。先收集細(xì)胞，破碎細(xì)胞，讓酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，然后進(jìn)行酶的提取和分離純化細(xì)胞破碎的方法：機(jī)械破碎法、物理破碎法、化學(xué)破碎法、酶促破碎法等。第46頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

細(xì)胞破碎方法及原理分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法搗碎法研磨法勻漿法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，從而使細(xì)胞破碎化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑添加表面活性劑通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎第47頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2、酶的提取酶的提取過程就是在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分地溶解到提取液中的過程。酶的提取方法：鹽溶液提取法、酸溶液提取法、堿溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法等。第48頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

酶的主要提取方法提取方法用于提取的溶劑提取的酶的性質(zhì)鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液在低鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液在稀酸溶液中溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液在稀堿溶液中溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑與脂類結(jié)合或者含較多非極性基團(tuán)的酶第49頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2、酶的提取酶的提取過程就是在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分地溶解到提取液中的過程。酶的提取方法：鹽溶液提取法、酸溶液提取法、堿溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法等。第50頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日3、酶的分離純化酶的純化就是把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來。包括：沉淀、過濾、層析、電泳、萃取、結(jié)晶、干燥等。第51頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日4、沉淀分離沉淀分離就是通過改變某些條件或添加某些物質(zhì)，使酶的溶解度降低，從溶液中沉淀析出而與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。包括：鹽析沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法。第52頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用酶（蛋白質(zhì)）在不同鹽濃度下的溶解度不同的原理，使酶或者雜質(zhì)析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)的特性，調(diào)節(jié)溶液的pH，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些性質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離第53頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日5、離心分離離心分離就是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使大小不同、密度不同的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心機(jī)：低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)。第54頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日5、離心分離低速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速8000r/min。主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速（1～2.5）×104r/min。用于細(xì)胞碎片和細(xì)胞器的分離超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速（2.5～12）×104r/min。主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器和病毒的分離純化、沉淀系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。第55頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日6、過濾分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將大小不同、形狀不同的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和各種高分子膜等。過濾類型：膜過濾（微濾以及超濾、反滲透、透析、電滲析等采用各種高分子膜作為過濾介質(zhì)），非膜過濾（將粗濾及部分微濾采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)）。第56頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日過濾的種類及特性類別截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾＞2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微過濾、微孔陶瓷超濾20A至2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透＜20A生物小分子、鹽、離子等反滲透膜第57頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日7、層析分離層析分離是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)）的不同，使各組分以不同比例分配在兩相中。其中一個(gè)相為固定相，另一個(gè)相為流動(dòng)相，當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分以不同發(fā)速度移動(dòng)，從而使不同的組分分離純化。第58頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中各組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而使各組分分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離第59頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日8、電泳分離帶電離子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過程稱為電泳。物質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向：帶正電荷的顆粒向電場(chǎng)的陰極移動(dòng)；帶負(fù)電荷的顆粒向陽極移動(dòng)；凈電荷為零的顆粒在電場(chǎng)中不移動(dòng)。顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要取決于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀、大小、電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH、離子強(qiáng)度、支持體的特性等外界條件的影響。第60頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日8、電泳分離電泳的方法：紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、自由電泳、等電聚焦電泳等。在酶學(xué)研究中，電泳技術(shù)主要用于酶的純度鑒定、酶的分子質(zhì)量測(cè)定、酶等電點(diǎn)測(cè)定以及少量酶的分離純化。第61頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日9、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。兩相指的是互不相溶的兩個(gè)液相或其他液體。按照兩相的組成不同，萃取可分為有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取等。第62頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日10、結(jié)晶結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。結(jié)晶的方法：鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、透析平衡結(jié)晶法、等電點(diǎn)結(jié)晶法等。第63頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日11、干燥干燥是將固體、半固體或濃縮液中的水分或其他溶劑除去一部分，以獲得含水分較少的固體物質(zhì)的過程。酶經(jīng)過干燥后，可以提高酶的穩(wěn)定性，利于產(chǎn)品保存、運(yùn)輸和使用。常用的干燥方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥和吸附干燥等。第64頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日12、在酶的分離純化工業(yè)中必須注意的問題（1）要注意防止酶變性失活除少數(shù)情況外，所有操作必須在低溫下進(jìn)行，特別是有機(jī)溶劑存在時(shí)更要特別小心；大多數(shù)酶在pH＜4或pH＞10的條件下不穩(wěn)定，故不能過酸過堿；酶溶液常易在表面上形成泡沫而變性，故應(yīng)防止泡沫的形成；重金屬能引起酶失效，有機(jī)溶液能使酶變性，微生物污染、蛋白酶能使酶分解，都必須予以防止。第65頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日在酶的分離純化工業(yè)中必須注意的問題（2）酶的分離純化的目的是將酶以外的所有雜質(zhì)盡可能除去，因此在不破壞酶所需的條件下，可使用各種“激烈”的手段，此外，由于酶和它的底物、抑制劑等具有親和性，當(dāng)這些物質(zhì)存在時(shí)，酶的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性又會(huì)發(fā)生—定的變化，從而提供了更多可供采用的條件和方法。第66頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日在酶的分離純化工業(yè)中必須注意的問題（3）通過檢測(cè)酶活性，跟蹤酶的來龍去脈，為選擇適當(dāng)方法和條件提供了直接依據(jù)。在工作過程中從原材料開始每步都必須檢測(cè)酶活性，—個(gè)好的方法和措施是使酶的純度提高倍數(shù)大，活力回收高，同時(shí)重復(fù)性好。第67頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日第三節(jié)化學(xué)修飾酶與化學(xué)人工酶一、酶的化學(xué)修飾化學(xué)修飾：是指通過酶分子的改造以達(dá)到結(jié)構(gòu)改性之目的，又稱“生物分子工程”。酶分子化學(xué)修飾方法種類繁多。根據(jù)修飾方法和部位的不同，酶分子的這種體外改造又可分酶的表面修飾和酶的內(nèi)部修飾。第68頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.酶的表面修飾①化學(xué)固定法一般是通過酶表面的酸性或堿性氨基酸殘基將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的環(huán)境的改變，會(huì)使酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。第69頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.酶的表面修飾②酶的小分子修飾用小分子共價(jià)修飾酶可使酶穩(wěn)定性提高。主要是利用些適宜的小分子修飾劑來修飾酶表面的一些基團(tuán)，如：—COO-、—NH3+、—SH、—OH、咪唑基等。第70頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.酶的表面修飾③酶大分子修飾根據(jù)修飾分子的大小和對(duì)酶分子的作用方式可分為大分子的非共價(jià)修飾和大分子的共價(jià)修飾兩類。第71頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.酶的內(nèi)部修飾①非催化活性基團(tuán)的修飾經(jīng)常被修飾的殘基可以是親核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是親電子的(Tyr、Typ)，還可以是可氧化的(Tyr、Tpy、Met)。對(duì)這類非催化殘基的修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性態(tài)，改變酶對(duì)特殊稀薄物的束縛能力。第72頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.酶的內(nèi)部修飾②酶蛋白主鏈修飾至今，酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶法。如將ATP酶用胰蛋白酶有限水解，切除其十幾個(gè)殘基后，酶活力提高了5.5倍。該活化酶仍為四聚體，亞單位分子量變化不大，說明天然酶并非總是處于最佳的催化構(gòu)象狀態(tài)。第73頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.酶的內(nèi)部修飾③催化活性基團(tuán)的修飾通過選擇性修飾氨基酸側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代，這種將一種氨基酸側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈的方法叫化學(xué)突變法，如Berder等人，將枯草桿菌蛋白酶活性部位的Ser殘基轉(zhuǎn)化為Cys殘基，新產(chǎn)生的巰基蛋白酶對(duì)肽或酯沒有水解能力，但能水解高度活化的底物如硝基苯酯。這種方法由于受到專一性試劑、有機(jī)化工業(yè)水平的限制，沒有蛋白質(zhì)工程技術(shù)普遍，但它通過產(chǎn)生非蛋白質(zhì)氨基酸能力，可以有力地補(bǔ)充蛋白質(zhì)工程技術(shù)。第74頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

二、化學(xué)人工酶根據(jù)酶的催化原理，模擬酶的生物催化功能，用有機(jī)化學(xué)和生物學(xué)的方法合成具有專一催化功能的酶的模擬物——人工酶（arti-ficialenzyme）。人工酶的制作有兩種：半合成酶和全合成酶。第75頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

二、化學(xué)人工酶1.半合成酶將具有一定結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合，使可形成新的生物催化劑——半合成酶(Semisyhtetieemyme)。①與金屬或金屬有機(jī)物的結(jié)合。有的半合成酶是與具有催化活性的金屬或金屬有機(jī)物結(jié)合形成的。②與特異性的物質(zhì)結(jié)合。有的半合成酶是與具有特異性的物質(zhì)相結(jié)合而形成的。第76頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

二、化學(xué)人工酶2.全合成酶這類人工酶不是蛋白質(zhì)，而是有機(jī)物，通過加入酶的催化基團(tuán)與控制空間的構(gòu)象，像自然酶那樣能選擇性地催化化學(xué)反應(yīng)，包括小分子有機(jī)物(大多為金屬絡(luò)合物)、抗體酶(催化抗體)和人工聚合物酶。①小分子有機(jī)物全合成酶。氨肽酶全合成酶、轉(zhuǎn)氨全合成酶、ATP水解全合成酶。②人工聚合物酶。第77頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日第四節(jié)固定化酶水溶性酶水不溶性載體固定化技術(shù)水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？第78頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

一、固定化酶的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好；酶反應(yīng)過程可以加以嚴(yán)格控制；產(chǎn)物中沒有酶的殘留，簡(jiǎn)化了工業(yè)設(shè)備；可以增加產(chǎn)物的得率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶使用效率高，成本降低。第79頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日

一、固定化酶的特點(diǎn)缺點(diǎn)：固定化時(shí)，酶活力有損失；增加了固定化的成本，在生產(chǎn)初期投資大；只能用于水溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜；與完整菌體相比，不適于多酶反應(yīng)；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離過程。第80頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日二、酶的固定化方法酶的固定化方法大致分為：1.物理法（1）吸附法（2）包埋法2.化學(xué)法（1）共價(jià)偶聯(lián)法（2）交聯(lián)法第81頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日共價(jià)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)第82頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日第83頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.吸附法分為物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法：通過氫鍵和π電子親和力等物理作用，將酶固定在水不溶載體上的方法。常用的載體：無機(jī)吸附劑如高嶺土、硅藻土、硅膠、磷酸鈣膠、微孔玻璃等。有機(jī)吸附劑有纖維素、骨膠原、賽璐玢、火棉膠等。第84頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日1.吸附法離子吸附法：離子吸附法是將酶同含有離了交換劑的水不溶性載體相結(jié)合。常用載體：①陰離子交換劑，如DEAE(二乙氨基乙基)-纖維素、TEAE(四乙氨基乙基)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；②陽離子交換劑，如CM-纖維素、纖維素-檸檬酸、Amberlite(G-50、IRC-120）等。第85頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.包埋法將聚合物單體和酶溶液混合，再借助于聚合促進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，使酶包埋于聚合物中以達(dá)到固定化。此法由于酶分子僅僅是被包埋，未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，故酶活力高，但此法不適宜作用于大分子底物。第86頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日2.包埋法包埋方法：

①聚丙烯酰胺凝膠包埋法②輻射包埋法③卡拉膠包埋法④大豆蛋白質(zhì)包埋法⑤微膠囊法。第87頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日3.共價(jià)偶聯(lián)法是指將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的酶的固定方法。酶與載體共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)：①氨基：Lys的ω-NH2和肽鏈N端的α-NH2；②羧基：Asp的β-羧基、Glu的γ-羧基和C端的α-羧基；③酚基、Tyr的酚環(huán)；④巰基：Cys的巰基；⑤羥基：Ser、Thr、Tyr的羥基；⑥咪唑基：His的咪唑基⑦吲哚基：Trp的吲哚基。常見的包括一NH2、一COOH、His的芳香環(huán)。第88頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日3.共價(jià)偶聯(lián)法載體直接關(guān)系列固定化酶的性質(zhì)和形成：①親水性載體在蛋白的結(jié)合量、固定化酶的活力和穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體；②載體需要結(jié)構(gòu)疏松、表面積大，且有一定的機(jī)械強(qiáng)度；③帶有在溫和的條件下可與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)；④最好沒有或很少專一性吸附；⑤載體應(yīng)便宜易得，并能反復(fù)使用。一般載體必須先活化。第89頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日4.偶聯(lián)反應(yīng)

①重氮化反應(yīng)：是帶芳香氨基常用的載體，載體先用HNO3處理成重氮鹽衍生物，然后在溫和的條件下與酶蛋白反應(yīng)。此法常用的載體有：a.多糖類和芳香氨基衍生物；b.氨基酸的共聚物；c.聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯馬來酸共聚體與多孔玻璃等。第90頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日4.偶聯(lián)反應(yīng)②異硫氰酸酯反應(yīng)：

含芳香氨基的載體先用硫芥子處理(如光氣)制成異硫氰酸的衍生物，得到的產(chǎn)物極易在溫和條件下和酶分子起反應(yīng)，在中性pH值它就與α-NH2起反應(yīng)。③溴化氫-氨碳酸基反應(yīng)④芳香烴化反應(yīng)⑤疊氮反應(yīng)⑥酸酐反應(yīng)第91頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日4.偶聯(lián)反應(yīng)⑦縮合反應(yīng)⑧巰基-二巰基交換反應(yīng)⑨金屬偶聯(lián)反應(yīng)第92頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日5.交聯(lián)法利用雙/多功能試劑在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以制備固定化酶。交聯(lián)劑根據(jù)它們的功能基團(tuán)的相同或不相同可分為“同型”或‘‘雜型’”兩類，前者如戊二醛、苯基二異硫氰；后者如甲苯-2-異氰-4-異硫氰等，其中戊二醛用得最多。交聯(lián)反應(yīng)可以發(fā)生在酶分子之間，也可以發(fā)生在酶分子內(nèi)部，酶濃度低時(shí)發(fā)生在酶分子內(nèi)部，高酶濃度下分子間交聯(lián)比例上升形成固定化酶后往往為不溶態(tài)。第93頁，共106頁，2023年，2月20日，星期日