ngs與其他檢測(cè)序技術(shù)流程的對(duì)比

ngs與其他檢測(cè)序技術(shù)流程的對(duì)比臨床常用診斷技術(shù)2腫瘤診斷方法影像學(xué)診斷：超聲，CT，MRI，PET，PET-CT組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷：

-HE染色-辨別腫瘤細(xì)胞及分型免疫組化診斷：-利用抗原抗體結(jié)合反應(yīng)原理

-針對(duì)蛋白類腫瘤標(biāo)記物（癌胚抗原，糖類抗原，

甲胎蛋白等）的檢測(cè)-鑒別組織來(lái)源分子診斷：

-熒光原位雜交（FISH）、基因探針及標(biāo)記、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、

DNA序列分析（sanger測(cè)序、ARMS法、二代測(cè)序）等-針對(duì)腫瘤的癌基因/抑癌基因、生長(zhǎng)因子及受體,以及腫瘤相關(guān)的某些染色體

位點(diǎn)異常的檢測(cè)

3組織病理學(xué)檢查仍是癌癥診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”ACSCSCCLC4FISH

ARMS腫瘤點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本腫瘤病理診斷治療已進(jìn)入個(gè)體化分子時(shí)代

免疫組化

一代測(cè)序

數(shù)字PCR

二代測(cè)序檢測(cè)方法的介紹免疫組化（IHC）熒光原位雜交（FISH）桑格測(cè)序（Sanger測(cè)序法）擴(kuò)增阻滯突變（ARMS）-PCR法數(shù)字PCR（ddPCR）二代測(cè)序檢測(cè)方法介紹6免疫組化染色原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。免疫組化是從蛋白層面看問題的，與測(cè)序不同，一個(gè)是因（DNA），一個(gè)是果（Protein），所以體內(nèi)出現(xiàn)一些未知突變，如果對(duì)蛋白功能產(chǎn)生影響，也是可以看出來(lái)的。70分1分2分3分熒光原位雜交（FISH）定義：熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。它的基本原理是：如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。分析9熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)——以HER2為例FISH檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞HER2擴(kuò)增代表性圖例高倍擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增DNA序列測(cè)定的意義

DNA的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。桑格測(cè)序原理原理：利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。

13Sanger測(cè)序的流程結(jié)果解讀擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS)-又稱等位基因特異性擴(kuò)增（ASA），利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物。ARMS（ASA）的特點(diǎn)是：“只有在引物3’堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，野生型的不擴(kuò)增”優(yōu)勢(shì)? 靈敏度高，重復(fù)性好，對(duì)標(biāo)本突變率要求底? 操作簡(jiǎn)單，儀器費(fèi)用較低廉? 檢測(cè)時(shí)間短不足? 僅能檢測(cè)已知突變類型? 不能得到具體堿基突變類型ARMS法檢測(cè)16數(shù)字微滴PCR(ddPCR)通過(guò)將微量樣品擴(kuò)大倍數(shù)稀釋和分液(partitioning)，直至每個(gè)樣品中所含有的待測(cè)分子數(shù)不會(huì)超過(guò)1個(gè)，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)的樣品逐個(gè)進(jìn)行計(jì)數(shù)的一種技術(shù)。Copyright?2016.GENESEEQTechnologyInc.Allrightsreserved.ddPCR的工作流程原理是在Sanger測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP。通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則逐一的添加標(biāo)記過(guò)的dNTP，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)識(shí)別、轉(zhuǎn)換，從而生成相應(yīng)的序列信息。新一代高通量測(cè)序(NGS)的原理四色熒光判別ATCG四種堿基

激光超高分辨率照相機(jī)

Miseq為首個(gè)FDA批準(zhǔn)臨床的高通量測(cè)序儀

國(guó)際NGS高分文章，絕大多數(shù)使用Hiseq平臺(tái)18新一代高通量測(cè)序(NGS)能同時(shí)檢測(cè)不同形式的基因突變

MarcLadanyi.2015ASCOAnnualMeeting19檢測(cè)方法比較檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)可檢測(cè)的變異形式AMRS-PCR1、靈敏度3%-10%2、擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，封閉的體系，減少污染的可能性1、只能檢測(cè)已知突變2、如果檢測(cè)突變點(diǎn)或者類型較多，出現(xiàn)特異產(chǎn)物概率也增加3、當(dāng)檢測(cè)位點(diǎn)較多時(shí)，對(duì)DNA樣本需求增加點(diǎn)突變、小片段插入/缺失無(wú)法測(cè)融合、大片段以及熱點(diǎn)測(cè)序熒光原位雜交FISH1、靈敏度高、特異度高2、空間定位準(zhǔn)確，可同時(shí)分析分裂期和間期多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量1、通量低、成本高2、對(duì)操作和判讀技術(shù)要求高，不同讀片者判讀差異較大拷貝數(shù)變化、大片段插入/缺失、融合/重排。擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)免疫組化IHC1、可對(duì)組織和細(xì)胞中相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位及定量研究2、經(jīng)濟(jì)快捷1、抗體的選擇2、檢測(cè)者組織的固定3、觀察者解釋方面的差異僅檢測(cè)蛋白表達(dá)水平Sanger測(cè)序1、測(cè)序長(zhǎng)度2、準(zhǔn)確性高，靈敏度20%-30%3、能處理的處理重復(fù)序列和多聚序列1、通量低、成本高2、對(duì)樣本中腫瘤細(xì)胞的含量和比例要求較高3、靈敏度低點(diǎn)突變、小片段插入/缺失二代測(cè)序1、大規(guī)模、高通量2、能檢測(cè)各種變異形式3、靈敏度1%-3%1、成本較高2、引入PCR過(guò)程會(huì)在一定程度上增加測(cè)序的錯(cuò)誤率，并且具有系統(tǒng)的偏向性，同時(shí)讀長(zhǎng)也比較短3、對(duì)數(shù)據(jù)注釋和報(bào)告解讀要求高點(diǎn)突變擴(kuò)增融合/重排插入/缺失20各種方法檢測(cè)的對(duì)比方法檢測(cè)層面樣本需求優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)IHCProtein組織直接展現(xiàn)表達(dá)結(jié)果，直觀主觀判斷，對(duì)操作人員要求較高，陽(yáng)性判定不確定ARMSDNA組織，血液速度快，精準(zhǔn)度較高無(wú)法測(cè)融合，擴(kuò)增及大片段測(cè)序，熱點(diǎn)測(cè)序ddPCRDNA組織，血液?jiǎn)挝稽c(diǎn)精準(zhǔn)度非常高，可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)多位點(diǎn)血檢匹配度不高，熱點(diǎn)測(cè)序FISHDNA組織擴(kuò)增是金標(biāo)準(zhǔn)，并且可以測(cè)融合主觀判斷，對(duì)操作人員要求較高，對(duì)融合的判別要求非常高，結(jié)果容易出錯(cuò)世和DNA/RNA普適性一次檢測(cè)所有突變類型，多基因，精準(zhǔn)度高價(jià)格略高，周期略長(zhǎng)21總結(jié)

SummaryNGS只需要微量樣本就可以一次性檢測(cè)所有的突變類型FISH做擴(kuò)增與融合對(duì)實(shí)驗(yàn)室研判人員的要求較高，NGS通過(guò)優(yōu)化算法，降低人工出錯(cuò)的比率。陰性對(duì)照極為重要，具有質(zhì)控和探查種系突變的作用ARMS,ddPCR等傳統(tǒng)一代測(cè)序方法在熱點(diǎn)測(cè)序這一塊的確精準(zhǔn)度較高，但是本質(zhì)上仍舊是熱點(diǎn)測(cè)序，不能滿足越來(lái)越大的檢測(cè)需求世和專有探針庫(kù)保證了前期提取的DNA質(zhì)量22NGS&ctDNA技術(shù)優(yōu)勢(shì)NGS技術(shù)特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)檢測(cè)全面精準(zhǔn)度高周期短樣本需求少全自動(dòng)化的大數(shù)據(jù)分析方法時(shí)時(shí)更新的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)高通量單次檢測(cè)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的多種突變包括單堿基突變、堿基缺失、堿基插入和基因融合單次反應(yīng)只能針對(duì)一種突變進(jìn)行檢測(cè)，并只能檢測(cè)一種突變類型同時(shí)對(duì)416個(gè)致癌基因進(jìn)行測(cè)序展現(xiàn)所有突變每次反應(yīng)只檢測(cè)單個(gè)基因一種突變世和的技術(shù)在單次檢測(cè)中對(duì)每個(gè)堿基覆蓋600次以上，杜絕假陽(yáng)/陰性結(jié)果技術(shù)局限，假陽(yáng)/陰性錯(cuò)誤率高只需一次微量

腫瘤樣本，并且可以檢測(cè)手術(shù)樣本，血液/積液樣本，F(xiàn)FPE石蠟樣本等多次檢測(cè)導(dǎo)致樣本量大、價(jià)格高、耗時(shí)長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的算法優(yōu)化和分析自動(dòng)化，快速處理海量病人數(shù)據(jù)，杜絕人為錯(cuò)誤技術(shù)局限無(wú)法及時(shí)有效處理海量病人數(shù)據(jù)以FDA逾三萬(wàn)份臨床數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，報(bào)告切實(shí)有用，有效幫助醫(yī)生和病人選擇高敏感性的藥物不同實(shí)驗(yàn)室的各種報(bào)告而造成的信息重復(fù)或混亂，無(wú)法保證臨床數(shù)據(jù)庫(kù)的完善性和時(shí)效性檢測(cè)流程高度自動(dòng)化，7天提供全面準(zhǔn)確報(bào)告多次反復(fù)測(cè)試，造成耗時(shí)長(zhǎng)，而且由于技術(shù)局限無(wú)法提供全面的報(bào)告上一代傳統(tǒng)基因檢測(cè)高通量測(cè)序NGS與液體活檢結(jié)合可有效解決傳統(tǒng)檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)ctDNA液體活檢?特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)26克服腫瘤異質(zhì)性與組織高度匹配取樣無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)耐藥情況有效評(píng)估預(yù)后NatRevClinOncol.2013Aug;10(8):472-84.沒有組織怎么辦？？？初始診斷性活檢是通過(guò)組織病理學(xué)、免疫組化和分子學(xué)特征描繪進(jìn)行評(píng)估的，根據(jù)結(jié)果制訂治療方案在獲得性耐藥時(shí)進(jìn)行再活檢，并采用同樣的方法重新分析以發(fā)現(xiàn)耐藥時(shí)收集的標(biāo)本與治療前標(biāo)本的差異該過(guò)程在各治療階段時(shí)重復(fù)進(jìn)行應(yīng)形成可能的細(xì)胞株和患者衍生的移植瘤模型以促進(jìn)耐藥機(jī)制和治療作用的功能性研究PolitiK,etal.ClinCancerRes.2015May15;21(10):2213-20.分子學(xué)特征和再活檢與癌癥治療的整合27檢測(cè)全面?克服腫瘤異質(zhì)性腫瘤具有復(fù)雜的時(shí)空異質(zhì)性不同位置具有不同病灶腫瘤亞克隆AndriyMarusyk,etal.NatureReviewCancer.2012.AlmendroV,etal.Annualreviewofpathology2013.由于組織檢測(cè)只取樣于腫瘤的某一部位，無(wú)法衡量腫瘤組織的異質(zhì)性，導(dǎo)致檢測(cè)信息不全面。ctDNA：由于ctDNA來(lái)源于患者體內(nèi)不同位置的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)經(jīng)過(guò)人體天然血液循環(huán)系統(tǒng)混勻，其攜帶的腫瘤基因信息更全面，規(guī)避了腫瘤組織的異質(zhì)性。靈敏度高?準(zhǔn)確度高?假陽(yáng)性率低Zhengetal.SciRep

6:

20913(2016).Thierryetal.NatMed.2014;

20(4):319-449.為什么要進(jìn)行ctDNA基因檢測(cè)現(xiàn)有的基于血清蛋白生物標(biāo)記物（例如CA-125和PSA）的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法存在一定數(shù)量的假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果，并不能對(duì)腫瘤的進(jìn)展做出準(zhǔn)確判斷ctDNA可從血液中較易分離（liquid

biopsy），并攜帶腫瘤特異性的體細(xì)胞突變，因此極為適合作為腫瘤無(wú)創(chuàng)診斷及監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)記物對(duì)ctDNA進(jìn)行基因檢測(cè)還可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)后產(chǎn)生的抗藥性突變，而及時(shí)對(duì)治療方案進(jìn)行調(diào)整盡管腫瘤本身是腫瘤DNA的最直接來(lái)源，但是通過(guò)活檢或手術(shù)獲取腫瘤組織是侵入性的，具有一定風(fēng)險(xiǎn)的。而且有些癌癥病人不宜進(jìn)行手術(shù)，無(wú)法獲得腫瘤組織進(jìn)行基因檢測(cè)，以幫助制定治療方案30ctDNA檢測(cè)中遇到的問題及挑戰(zhàn)

ctDNA總量取決于：樣品提供人的健康狀態(tài)取血及保存運(yùn)輸血液/血漿樣品的條件血漿的制備方法DNA的提取方法以及DNA的定量方法世和基因的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：大幅提高ctDNA回收率從微量ctDNA建立測(cè)序文庫(kù)ctDNA在血液中含量極少，片段較小，提取方法及其重要1建庫(kù)及富集的產(chǎn)量2事實(shí)上，ctDNA檢測(cè)的核心在于前期準(zhǔn)備以確保ctDNA文庫(kù)的多樣性，保證被檢測(cè)樣本有代表性是下游測(cè)序及分析的基石31那么多公司，為什么選擇我們？

世和的優(yōu)勢(shì)32世和的優(yōu)勢(shì)來(lái)自于——步步優(yōu)化，精益求精33世和的優(yōu)勢(shì)來(lái)自于——步步優(yōu)化，精益求精優(yōu)勢(shì)在于每步優(yōu)化！QC步驟34樣本收集－兩小時(shí)之內(nèi)分離血漿收到血樣后2小時(shí)內(nèi)分離血漿血漿多種運(yùn)輸條件實(shí)驗(yàn)室模擬不能輸在起跑線上！運(yùn)輸全血至總部再分離血漿季節(jié)地域溫差大，影響質(zhì)量直接影響檢出率世和基因其他公司SciTranslMed.Aug26,2015;7(302):302ra1332小時(shí)內(nèi)收集血漿是臨床試驗(yàn)、高分論文金標(biāo)準(zhǔn)！分離全血收集血漿，時(shí)間精至分鐘！35DNA提取I－血漿ctDNA－富集小片段ctDNA，去除干擾小片段含腫瘤特異突變大片段不含腫瘤特異突變血漿DNA經(jīng)過(guò)大小片段分離有效富集小片段ctDNA！更豐富的起始原料世和基因數(shù)據(jù)36DNA提取II－石蠟組織－自主研發(fā)基于qPCR的樣本質(zhì)控0.5率先使用熒光定量PCR法用于FFPE樣本質(zhì)控自主設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)>8個(gè)參數(shù)計(jì)算模型，確保通過(guò)QC樣本測(cè)序質(zhì)量避免交聯(lián)過(guò)于嚴(yán)重的石蠟樣本進(jìn)入流程測(cè)序質(zhì)量好測(cè)序質(zhì)量差世和基因數(shù)據(jù)，基于100例臨床病人石蠟樣本測(cè)序結(jié)果37樣本建庫(kù)－不計(jì)成本的大量進(jìn)口試劑優(yōu)化上百種進(jìn)口試劑反復(fù)搭配優(yōu)化極大提升建庫(kù)效率38靶向富集I－基因捕獲探針Mass

spec質(zhì)控單獨(dú)合成基因靶向富集－15000余個(gè)探針探針庫(kù)反復(fù)優(yōu)化14次，歷時(shí)3年，保證每個(gè)基因每個(gè)外顯子覆蓋探針單個(gè)合成，Mass

Spec保證質(zhì)量7項(xiàng)核心專利探針單獨(dú)合成質(zhì)譜分析純化世和探針庫(kù)剪切探針庫(kù)芯片大規(guī)模合成芯片合成探針的缺點(diǎn)：大規(guī)模一次合成多個(gè)探針統(tǒng)一剪切探針的完整性等品質(zhì)無(wú)任何保證大部分探針都不完整，導(dǎo)致基因捕獲效率大大降低芯片合成探針的缺點(diǎn)反復(fù)15000次39靶向富集II－為什么一定要“好”探針？什么是探針的均一性（Uniformity）？探針覆蓋不均一探針覆蓋均一ALK19內(nèi)含子測(cè)序數(shù)據(jù)的重要參數(shù)，除了測(cè)序深度，還有探針均一程度換句話說(shuō)，如果EGFR覆蓋3000X，而ALK只覆蓋300X，將會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)敏感性檢測(cè)靈敏度是由覆蓋最低的基因決定的如不均一，等于沒測(cè)！40世和基因IlluminaHiseq4000/Miseq其他測(cè)序公司IlluminaNextseq500四色熒光判別ATCG四種堿基

激光超高分辨率照相機(jī)Miseq為首個(gè)FDA批準(zhǔn)臨床的高通量測(cè)序儀國(guó)際NGS高分文章，絕大多數(shù)使用Hiseq平臺(tái)二色熒光判別ATCG

LED照相機(jī)

準(zhǔn)確率和靈敏度較差主要用于產(chǎn)前檢測(cè)上樣測(cè)序－Illumina

Hiseq4000/Miseq與國(guó)際接軌41數(shù)據(jù)分析