發(fā)酵工藝中種子擴(kuò)大培養(yǎng)課件

第四節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)

一.種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的增大需要種子就增多

種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、性能穩(wěn)定、接種數(shù)量足夠的、純的培養(yǎng)物。

菌種的活化與種子的擴(kuò)大培養(yǎng)的區(qū)別？

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的

為發(fā)酵罐的投料提供足夠數(shù)量的代謝旺盛的種子。因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短和接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時(shí)間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機(jī)會(huì)。

對(duì)于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長(zhǎng)繁殖速度快慢及生產(chǎn)的規(guī)模決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級(jí)數(shù)。

二. 種子擴(kuò)大培養(yǎng)(制備)階段

實(shí)驗(yàn)室種子的制備：生產(chǎn)車間種子制備:

A

實(shí)驗(yàn)室種子的制備：

e.g產(chǎn)黃青霉菌(P.chrysogonum)原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生產(chǎn)菌）原始菌種（出發(fā)菌種）固體試管斜面（32°C，18~24小時(shí)）

三角瓶培養(yǎng)（搖床）(flaskculture)

種子罐培養(yǎng)e.g.yeast：原始菌種（出發(fā)菌種）10ml麥汁試管250ml三角瓶培養(yǎng)（27°C~28°C，3天）（25°C，2天）5~10L卡氏罐（15°C~20°C，3~5天）B：生產(chǎn)車間種子制備：種子罐的作用：使有限數(shù)量的孢子(菌體)發(fā)芽、生長(zhǎng)、并繁殖成大量的菌絲體(菌體)，滿足發(fā)酵罐的需要（菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成）。實(shí)驗(yàn)室種子進(jìn)入種子罐有孢子進(jìn)罐法和搖瓶菌種進(jìn)罐法。

種子罐級(jí)數(shù)的確定：種子罐級(jí)數(shù)是指制備種子逐級(jí)擴(kuò)培的次數(shù)。依據(jù)：菌種生長(zhǎng)特性，孢子發(fā)芽及菌體繁殖的速度以及所用的發(fā)酵罐的容積。種子罐(seedingtank)的級(jí)數(shù)產(chǎn)物的品種生產(chǎn)規(guī)模工藝條件種子罐級(jí)數(shù)越少越好，原因：簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝和控制減少接種帶來的染菌機(jī)會(huì)需考慮：盡量延長(zhǎng)發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時(shí)間，縮短由于種子發(fā)芽、生產(chǎn)而占用的非生產(chǎn)時(shí)間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率［產(chǎn)物／ml·h］。e.g.Glutamatefermentation一級(jí)種子擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室種子種子罐發(fā)酵罐e.g.penicillinfermentation二級(jí)種子擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室種子一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐發(fā)酵罐e.g.Streptomycin

fermentation三級(jí)種子擴(kuò)培實(shí)驗(yàn)室種子一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐三級(jí)種子罐發(fā)酵罐

(Streptomycesgriseus)－－灰色鏈霉菌

接種量(seedvolume)指移入的種子的體積和接種后培養(yǎng)液的體積比。Antibiotic：

7%~7.5%Glu：1%接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度。采用較大接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖到達(dá)高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物形成提前。原因：1、種子多，種子液中含有大量的胞外水解酶，有利于對(duì)基質(zhì)的利用２、生產(chǎn)菌迅速占據(jù)了整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少染菌機(jī)會(huì)。但過多，易使菌體（菌絲體）生長(zhǎng)過快，培養(yǎng)液粘度增加，溶氧降低，產(chǎn)物合成受影響。

e.g.嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶接種1%，酶活最高；1.5%~4%影響不大；大于4%，酶產(chǎn)量明顯下降。制霉菌素生產(chǎn)中，1%比10%效果好，0.1%與1%效果相當(dāng)。

發(fā)酵生產(chǎn)的趨勢(shì)：采取大接種量及豐富培養(yǎng)基。如谷氨酸：大接種量20%，高生物素，高青霉素的強(qiáng)制發(fā)酵工藝。

有的采用雙種法增大接種量：兩只種子罐一只發(fā)酵罐如卡那霉素：雙種比單種的發(fā)酵單位（fermentationtiterunit）提高8%，到達(dá)產(chǎn)量高峰的時(shí)間提前。

倒種法：將培養(yǎng)適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一個(gè)發(fā)酵罐作為種子。如鏈霉素：倒種法比單種法的發(fā)酵單位提高12%。

三.影響種子質(zhì)量的因素

1.原材料質(zhì)量：如四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中配制孢子培養(yǎng)基的麩皮（wheatbran）、霉菌用的大（小）米、瓊脂的牌號(hào)的不同、蛋白胨加工原料不同等均影響種子的質(zhì)量。原料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中的無機(jī)鹽含量的不同，如微量元素Mg++、Ca++、Ba++能刺激孢子的形成。P含量的多少也影響種子的質(zhì)量。氨基酸發(fā)酵中，淀粉水解糖制備后，加入其他的營(yíng)養(yǎng)物（麩皮水解液、豆餅水解液、玉米漿），也對(duì)種子質(zhì)量多少有些影響。

一般情況：培養(yǎng)基糖分要少，氮源要多，無機(jī)鹽所占的比例要大。種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分趨于一致也有好處，種子很快適應(yīng)，但各成分的數(shù)量根據(jù)目的各自確定?？傊?，各成分選擇得當(dāng)，才能發(fā)揮菌種的特征，提高產(chǎn)量。

四.種子質(zhì)量的控制措施必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境條件，保證無雜菌侵入

1.菌種穩(wěn)定性的檢查：少量菌種--無菌生理鹽水--遞增稀釋--平板劃線培養(yǎng)。挑出形態(tài)整齊，孢子豐滿的菌落進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定其生產(chǎn)能力。

2.無菌檢查：顯微鏡觀察、種子液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、生化分析。種子液平板劃線、斜面培養(yǎng)用肉眼觀察是否有異常菌落、異?，F(xiàn)象及鏡檢是否有雜菌。五.種子質(zhì)量的判斷：

考察種子在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。感官判斷：看顏色、聞氣味理化指標(biāo)測(cè)定：1、pH值2、培養(yǎng)基滅菌后的糖、氨基氮3、菌體形態(tài)、濃度4、產(chǎn)物量5、殘?zhí)菨舛?、酶活力（如土霉素生產(chǎn)，淀粉酶的活力與發(fā)酵單位有一定的關(guān)系）。六.工業(yè)微生物培養(yǎng)的類型靜置培養(yǎng)法：即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，也稱為嫌氣性培養(yǎng)

(anaerobicculturing)通氣培養(yǎng)法：生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長(zhǎng)的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長(zhǎng)和發(fā)酵，也稱為好氣性培養(yǎng)

(aerobicculturing)。

3液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）法：(liquidsubmerged

culturing)

液體深層發(fā)酵法從罐底部通氣，進(jìn)入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐的底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。液體曲(liquidkoji)、檸檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinicacid)及其他發(fā)酵產(chǎn)品先后采用此法進(jìn)行生產(chǎn)。

特點(diǎn)：容易按照生產(chǎn)菌種對(duì)于代謝的營(yíng)養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣、攪拌、溫度、培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。外循環(huán)帶升式發(fā)酵罐

內(nèi)循環(huán)帶升式發(fā)酵