放射免疫實驗

放射免疫實驗第1頁/共50頁第三章放射免疫分析技術(shù)第2頁/共50頁體外放射分析技術(shù)利用放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)在體外進行體內(nèi)物質(zhì)種類和含量的分析測定。競爭性放射分析——放射免疫分析（RIA）非競爭性放射分析——免疫放射分析（IRMA）第3頁/共50頁

待測物質(zhì)濃度與檢測手段

臨床化學分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitaminsSerumProteins第4頁/共50頁第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應用第5頁/共50頁放射免疫分析的創(chuàng)立1959美國Yalow&Berson1960英國Ekim’s1977獲諾貝爾醫(yī)學生物學獎醫(yī)學生物學超微量分析的里程碑第6頁/共50頁1959年，Yalow和Berson創(chuàng)立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年獲得諾貝爾生物醫(yī)學獎。這種方法結(jié)合了放射性核素測量的高靈敏性和免疫抗原-抗體反應的高特異性兩大特點，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的先河。女科學家R.Yalow放射免疫分析法

（Radioimmunoassay，RIA）第7頁/共50頁基本原理Ag+AbAg-Ab

+

Ag*

Ag*-Ab

競爭結(jié)合：放射性標記的抗原（Ag*）和非標記的抗原（Ag）在同一反應系統(tǒng)中與特異性抗體（Ab）的競爭性結(jié)合。第8頁/共50頁在上反應式中：Ag與Ag*的免疫活性相同，即與Ab有相同的親和力；Ab的結(jié)合位點數(shù)＞Ag或Ag*，但＜Ag+Ag*；Ag*與Ab的量是恒定的，Ag是待測量。第9頁/共50頁二種抗原(Ag、Ag*)與Ab結(jié)合的量取決于兩者的濃度比例，Ag量多，則AgAb結(jié)合多，Ag*Ab結(jié)合量就少，即Ag*Ab將隨Ag的增加而減少，呈負相關(guān)，表現(xiàn)為函數(shù)關(guān)系。在系統(tǒng)中，Ag*Ab的量可通過測定放射性而獲得，再根據(jù)函數(shù)關(guān)系求Ag的量。第10頁/共50頁++++++++BoundFreeAgAb第11頁/共50頁標準曲線標準曲線又稱為劑量反應曲線，以一系列遞增濃度的Ag及一定量的Ag*與恒定量限量的Ab競爭結(jié)合反應而得，是對待測物進行定量分析的基礎(chǔ)。第12頁/共50頁標準曲線實例

第13頁/共50頁標準曲線:①配制一系列已知濃度的標準抗原，分別向其中加入固定量的標記抗原和抗體，反應平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測定*Ag-Ab的放射性B。②B0為標準抗原濃度=0時的放射性值。第14頁/共50頁放免分析基本條件（一）標準抗原（二）特異性抗體（三）標記抗原（四）分離技術(shù)第15頁/共50頁a.概念：是指已知真實含量，且不含對免疫反應產(chǎn)生干擾雜志的抗原。b.用途：免疫動物制備抗體——Ab

放射性核素標記——Ag*

繪制劑量反應曲線c.

要求：高純度高準確度良好的穩(wěn)定性

（一）標準抗原

第16頁/共50頁（二）特異性抗體

a.對特異性結(jié)合抗體的要求：1．親和力（affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合的能力，用親和常數(shù)Ka

值表示，反映靈敏度，Ka應達109~1012mol/L。2．特異性高：與待測抗原的結(jié)合力高，而與待測抗原類似物的結(jié)合能力（交叉反應率）低。3．滴度（效價）高：指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價越高。4．穩(wěn)定性好：能長期保存，化學性質(zhì)、效價穩(wěn)定。第17頁/共50頁b.

抗血清的制備：1.大分子物質(zhì)可直接免疫動物誘導抗體產(chǎn)生，但是小分子物質(zhì)為半抗原，必須與載體結(jié)合制成人工抗原（半抗原-蛋白質(zhì)），才能進行免疫。2．選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊。3．應用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）。4．選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點）、間隔時間（加強）與次數(shù)。第18頁/共50頁c.單克隆抗體的使用：

特異性高

親和力低，不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體第19頁/共50頁對標記抗原的要求：1．放射性比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強度高，一般至少達到370GBq/mmol。2．免疫活性：與標記前一致。3．放射化學純度高：應>95%。4．穩(wěn)定性好：標記的同位素不易脫落。（三）標記抗原

第20頁/共50頁常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器：（1）γ計數(shù)儀（2）β液體閃爍計數(shù)器

第21頁/共50頁兩種標記方法的優(yōu)缺點

3H標記物125I標記物

貨架期長貨架期短以3H置換H，對原物質(zhì)以125I取代H，可能影響免疫活性無改變免疫活性標記難度大，比活度低標記方法簡單，比活度高

Β射線測量效率低γ射線測量效率高廢棄物處理較困難廢棄物處理較容易第22頁/共50頁a.

對分離方法的要求：1．使抗原-抗體復合物（B）與游離抗原（F）盡可能分離完全；2．分離后便于放射性測量；3．分離效果不受外界干擾因素的影響；4．操作簡便、分離迅速、重復性好；5．與游離標記物的非特異性結(jié)合盡可能小；6.試劑來源廣泛、價格低廉。（四）分離技術(shù)

第23頁/共50頁b.

常用的分離方法

1.雙抗體法特點：分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價高，但分離時間長，成本高。第24頁/共50頁2.沉淀法聚乙二醇（w=6000）特點：快速，價廉，來源方便，受環(huán)境影響大3.雙抗體PEG法將雙抗體和沉淀法兩者結(jié)合進行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點，并克服了雙抗體分離時間長和沉淀法非特異性結(jié)合高的缺點。第25頁/共50頁4．固相分離法將抗體通過特殊技術(shù)聯(lián)結(jié)在固相載體上，免疫反應在固相載體上完成，達到平衡后形成固相的Ag-Ab

復合物，可與游離部分分離。此方法具有操作簡便，迅速，分離效果好，非特異性結(jié)合低等優(yōu)點。第26頁/共50頁第27頁/共50頁5.磁化分離法6.葡萄球菌A蛋白分離法（SPA分離法）7.微孔濾膜法第28頁/共50頁放免分析的優(yōu)點靈敏度高特異性強精確度高用血量少缺點：污染；放射性核素衰變及不穩(wěn)定第29頁/共50頁第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應用第30頁/共50頁1968年，Miles和Hales創(chuàng)立了免疫放射分析法（IRMA）。IRMA與IRA不同，它是將放射性核素標記在抗體上，而不是標記在抗原上。同時所用的標記抗體與待測抗原比較是過量的。

Ag+Ab*Ag-Ab*+Ab*BF由上式可見，IRMA不存在競爭反應，是待測抗原直接與標記抗體反應。待測抗原的量與抗原-標記抗體復合物的量成正相關(guān)關(guān)系。

免疫放射分析法

（immunoradiometricassay，IRMA）第31頁/共50頁1.單位點IRMA單位點（one-site）IRMA是利用過量的標記抗體（Ab*）與待測抗原（Ag）進行免疫結(jié)合反應，形成抗原標記抗體復合物，當反應達到平衡后，再用固相抗原免疫吸附劑（SP-Ag）與剩余的標記抗體結(jié)合，并將其分離。第32頁/共50頁2.雙位點IRMA將抗體1結(jié)合于固相表面，加入標本后，待測抗原與固相抗體形成抗原-抗體復合物，并留在固相表面。洗去其他物質(zhì)后，加入標記抗體2，在固相表面形成抗體-抗原-標記抗體復合物，再洗去多余標記抗體，即可達到分離目的。第33頁/共50頁競爭性分析與非競爭分析的比較第34頁/共50頁第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應用第35頁/共50頁放射免疫分析技術(shù)的臨床應用一甲狀腺疾病二代謝類疾病三骨和礦物質(zhì)代謝四腫瘤五心血管疾病六器官移植中的藥物監(jiān)控第36頁/共50頁一甲狀腺疾病TSH促甲狀腺激素STSH高靈敏度甲狀腺激素FT3血清游離三碘甲狀腺原氨酸FT4游離甲狀腺素TgAb抗甲狀腺球蛋白抗體TmAb抗甲狀腺微粒體抗體第37頁/共50頁臨床上確診為甲狀腺功能亢進的步驟STSH,FT3,FT4STSH↓,FT3↑,FT4↑STSH↓,FT3↑,FT4正常STSH↓,FT3↑,FT4正常確診甲亢攝131Ⅰ率攝131Ⅰ率攝131Ⅰ率↑攝131Ⅰ率↓T4甲亢（伴有甲腫）病人服T3，（多無甲腫，F(xiàn)T4有時↓）攝131Ⅰ率↑攝131Ⅰ率↓T4甲亢（伴有甲腫）病人服T3，（多無甲腫）攝131Ⅰ率攝131Ⅰ率↑或正常攝131Ⅰ率↓①毒性彌漫性甲腫（Graves?。诙嘟Y(jié)節(jié)甲腫（結(jié)節(jié)性甲亢）③大的單個結(jié)節(jié)（自主性結(jié)節(jié)甲亢）有甲腫時多為：①亞甲炎伴甲亢②碘致甲亢③甲狀腺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌伴甲亢無甲腫時多為醫(yī)源性甲亢第38頁/共50頁臨床上確診為甲狀腺功能減退的步驟STSH,FT4STSH↑,FT4↓原發(fā)性甲低有甲狀腺腫無甲狀腺腫抗甲狀腺抗體陽性①131I治療后②甲狀腺手術(shù)后或甲腺外照射③無甲狀腺腫克丁病橋本甲狀腺炎抗甲狀腺抗體陰性①激素合成障礙②藥物引起（碘、鋰）③碘缺乏癥（地甲腫）抗甲狀腺抗體陽性抗甲狀腺抗體陽性抗甲狀腺抗體陰性第39頁/共50頁二代謝類疾病胰島素原（proinsulin）正常生理條件下，胰島素原分子釋放很少，占總分泌5%-10%，因此不考慮其對胰島素測定的影響。在病理情況下，如胰島素瘤，血中胰島素原可達50%-70%。目前，市場上已有用純胰島素原做為標準品的放免藥盒，可用來直接測定血清或血漿中的胰島素原含量。第40頁/共50頁人真胰島素(insulinspecific)不經(jīng)處理的血漿，通過放免法測得的胰島素稱為免疫反應性胰島素（IRI），IRI與胰島素原有明顯的交叉反應，當血清中胰島素原含量較高時，應考慮對胰島素測定的影響。人真胰島素放免分析可特異性測定人血清中與胰島素原無交叉反應的胰島素水平，是確切評價β細胞功能和胰島素敏感性的關(guān)鍵指標。第41頁/共50頁三骨和礦物質(zhì)代謝1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D體內(nèi)維生素D經(jīng)日光紫外線照射、且在C1和C25位羥基化后，才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘木S生素D代謝物。測定血清中1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D的濃度可鑒別與維生素代謝有關(guān)的疾病。目前國內(nèi)用維生素D放免藥盒用于維生素D缺乏癥、骨營養(yǎng)不良、肝炎和藥物性維生素D紊亂、甲狀旁腺功能亢進或減退的測定。第42頁/共50頁降鈣素（CT）和甲狀旁腺激素（PTH）CT及PTH參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制：當血鈣降低時，PTH分泌增加，作用于骨促進溶骨，鈣自骨釋出，同時作用于腎使腎小管對鈣回吸增多。血鈣上升則刺激甲狀腺分泌CT抑制骨鈣釋放，同時促進腎小球?qū)︹}的排出。CT和PTH的分泌功能彼此成反饋關(guān)系，機體通過它們互相拮抗作用維持代謝的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。降鈣素和甲狀旁腺激素對鈣代謝的調(diào)節(jié)不僅取決于它們在血中含量的絕對值，更重要是它們的比值。因此測定它們的比值對內(nèi)分泌代謝病研究很有價值。第43頁/共50頁骨鈣素（OC）骨鈣素由成骨細胞合成，在合成過程中不斷有少量骨鈣素釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，骨鈣素的水平直接反映骨骼生成狀況，其檢測可以幫助評價骨骼更新程度，高水平的骨鈣素與骨代謝病相關(guān)。整分子骨鈣素放免藥盒（intactOCIRMAkit）可以用于軟骨病、Paget骨病、甲狀腺功能亢進、腎性營養(yǎng)不良、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的檢測。第44頁/共50頁四腫瘤甲胎蛋白（AFP）甲胎蛋白作為一種腫瘤特異性抗原，對早期診斷原發(fā)性肝癌具有較高靈敏性和特異性。陽性率在60%~85%。癌胚抗原（CEA）癌胚抗原首先是從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，癌胚抗原升高和消化道腫瘤密切相關(guān)。胃癌患者陽性率可高達50%以上。第45頁/共50頁糖類抗原（carbohydrateantigen