系統(tǒng)生物學(xué)合成生物學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)詳解演示文稿

系統(tǒng)生物學(xué)合成生物學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有67頁\編輯于星期三優(yōu)選系統(tǒng)生物學(xué)合成生物學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)現(xiàn)在是2頁\一共有67頁\編輯于星期三合成基因組---Science論文Science

2

July

2010:

Vol.

329.

no.

5987,

pp.

52

-

56Creation

of

a

Bacterial

Cell

Controlled

by

a

ChemicallySynthesized

GenomeDaniel

G.

Gibson,1

John

I.

GlassetalWereportthedesign,synthesis,andassemblyofthe1.08–mega–basepairMycoplasma

mycoidesJCVI-syn1.0genomestartingfromdigitizedgenomesequenceinformationanditstransplantationintoaM.capricolumrecipientcelltocreatenewM.

mycoidescellsthatarecontrolledonlybythesyntheticchromosome.TheonlyDNAinthecellsisthedesignedsyntheticDNAsequence,including"watermark"sequencesandotherdesignedgenedeletionsandpolymorphisms,andmutationsacquiredduringthebuildingprocess.Thenewcellshaveexpectedphenotypicpropertiesandarecapableofcontinuousself-replication.現(xiàn)在是3頁\一共有67頁\編輯于星期三現(xiàn)在是4頁\一共有67頁\編輯于星期三合成生命的關(guān)鍵步驟FirstSelf-ReplicatingSyntheticBacterialCell20-May-2010

1)合成供體的基因組DNA：首先，將蕈狀支原體的全基因組測序，并按照該序列信息將其合成為1078條平均長度為1080bp的DNA片段。這些片段兩兩間具有80bp的部分重疊，所有片段拼接起來構(gòu)成蕈狀支原體的全長基因組。值得注意的是這些合成的片段較天然基因組略有一些改動，包括去除了14個不重要的基因、為阻斷基因而設(shè)計的兩個插入序列、27處單核苷酸多態(tài)性(其中19處在意料之中)以及4條用來區(qū)分于天然序列模本的“水印”標(biāo)記(Watermark)，這些改動都不影響細(xì)胞正常的生命活動。該過程涉及到計算機(jī)對合成序列的精密計算?，F(xiàn)在是5頁\一共有67頁\編輯于星期三2)合成DNA片段的拼接：將以上合成的1078條DNA片段分別連接到載體，使其能在酵母細(xì)胞中通過同源重組拼接起來。于是，平均1080bp的DNA片段，10個一組拼接為大約10kb的片段(109個)，然后將這些連接有目的基因片段的載體從酵母中分離出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli中進(jìn)行擴(kuò)增，以限制酶篩選出陽性克?。恢笤賹㈥栃钥寺≠|(zhì)粒中的這109條10kb左右的片段按同樣的方法每組10個拼接成100kb的片段(11個)；這11條片段最終拼接成完整的總共1077947bp的基因組(由于攜帶太大片段的載體在E.coli中不能穩(wěn)定傳代，因此后兩步拼接中采用多重PCR來篩選陽性克隆)。此過程除了2個銜接反應(yīng)是在體外用酶處理構(gòu)建，其余所有的片段都是在酵母細(xì)胞內(nèi)依靠同源重組拼接而成?，F(xiàn)在是6頁\一共有67頁\編輯于星期三3)人工基因組的甲基化修飾：由于供體細(xì)胞(蕈狀支原體)和受體細(xì)胞(山羊支原體)共用同一套限制酶系統(tǒng)，而天然的供體基因組是經(jīng)甲基化修飾的。因此，拼接完成的基因組DNA還需在體外用甲基化酶(從蕈狀支原體或山羊支原體提取物中純化)進(jìn)行修飾，以避免受體細(xì)胞限制酶系統(tǒng)的阻礙。4)人工基因組移植入受體細(xì)胞：將構(gòu)建好的人工合成基因組移植入山羊支原體內(nèi)。細(xì)胞經(jīng)過不斷分裂傳代，具有人造基因組的細(xì)胞在含抗生素的培養(yǎng)基中篩選出來，同時含有天然DNA的細(xì)胞逐漸消失殆盡。最終只剩下含有山羊支原體細(xì)胞質(zhì)但由合成DNA控制的人工嵌合體細(xì)胞。雖然蕈狀支原體和山羊支原體在基因組上75%是同源的，但該人造細(xì)胞明顯表現(xiàn)出蕈狀支原體的生長特性?，F(xiàn)在是7頁\一共有67頁\編輯于星期三合成生命操作圖解

取名

Synthia:人造兒創(chuàng)造這個可復(fù)制的試驗性單細(xì)胞生物花費(fèi)了4,000萬美元現(xiàn)在是8頁\一共有67頁\編輯于星期三人工合成基因組中的水印Thesecretaminoacidmessagescontainedin"watermarks"thatwereembeddedintheworld’sfirstmanmadebacterialgenome.NCBIcheckedintothegeneticsequencesubmittedbyVenter’sInstituteandfoundthewatermarkshiddeninplainsight.ThefivecodedmessagesthatwillgodowninhistoryasembeddedinthefirstsyntheticgenomeVENTERINSTITVTECRAIGVENTERHAMSMITHCINDIANDCLYDEGLASSANDCLYDE代表5個作者:CraigVenter,HamiltonSmith,JohnGlass,ClydeHutchison現(xiàn)在是9頁\一共有67頁\編輯于星期三人工基因組組裝與檢測現(xiàn)在是10頁\一共有67頁\編輯于星期三合成基因組結(jié)構(gòu)圖現(xiàn)在是11頁\一共有67頁\編輯于星期三Transcriptomics轉(zhuǎn)錄組學(xué)現(xiàn)在是12頁\一共有67頁\編輯于星期三Transcriptome:Anevolvingdefinition(Thepopulationof)mRNAsexpressedbyagenomeatanygiventime(Abbott,1999)轉(zhuǎn)錄組（Transcriptom）：細(xì)胞所包含mRNA的總和。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）：研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)；比較不同功能狀態(tài)下mRNA表達(dá)的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關(guān)的重要基因群。

現(xiàn)在是13頁\一共有67頁\編輯于星期三新定義Thecompletecollectionoftranscribedelementsofthegenome.(Affymetrix,2004)mRNArRNA,tRNAsnmRNAs(smallnon-messengerRNAs)microRNAsandsiRNAs(smallinterferringRNAs)snoRNAs(smallnucleolarRNAs)核仁小分子RNAsnRNAs(smallnuclearRNAs)Othernon-codingRNAsLongnon-codingRNA(lncRNA)現(xiàn)在是14頁\一共有67頁\編輯于星期三轉(zhuǎn)錄本All

transcripts

All

mRNAs現(xiàn)在是15頁\一共有67頁\編輯于星期三Transcriptomics

DefinitionThestudyofcharacteristicsandregulationofthefunctionalRNAtranscriptpopulationofacell/sororganismataspecifictime.ScopethepopulationoffunctionalRNA

transcripts.themechanismsthatregulatetheproductionofRNAtranscriptsdynamicsofthetrancriptome(time,celltype,genotype,externalstimuli)現(xiàn)在是16頁\一共有67頁\編輯于星期三一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究全部RNA的表達(dá)及功能轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指特定狀態(tài)下一種細(xì)胞或組織所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和?！ň幋aRNA，即mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）：是在整體水平上研究細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學(xué)。RNA組學(xué)（RNomics）：是分析、鑒定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定狀態(tài)下表達(dá)情況、功能及其與蛋白質(zhì)的相互作用?，F(xiàn)在是17頁\一共有67頁\編輯于星期三轉(zhuǎn)錄組的特點：受到內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，因而是動態(tài)可變的。能夠揭示不同物種、不同個體、不同細(xì)胞、不同發(fā)育階段及不同生理病理狀態(tài)下的基因差異表達(dá)信息?，F(xiàn)在是18頁\一共有67頁\編輯于星期三基于測序：cDNA文庫、illumina測序基于雜交：cDNA芯片（GeneChip，microarray）基因表達(dá)聚類轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法現(xiàn)在是19頁\一共有67頁\編輯于星期三（一）微陣列是大規(guī)?；蚪M表達(dá)譜研究的早期主要技術(shù)大規(guī)模表達(dá)譜或全景式表達(dá)譜（globalexpressionprofile）：是生物體（組織、細(xì)胞）在某一狀態(tài)下基因表達(dá)的整體狀況。微陣列或基因芯片（DNAchip）:利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光物標(biāo)記的來自不同細(xì)胞、組織或整個器官的DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA進(jìn)行雜交，然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進(jìn)行定量分析。現(xiàn)在是20頁\一共有67頁\編輯于星期三SpottedMicroarrayscDNAArraysOligoArrays

InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChips

IntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramicsSiliconOthermaterials不同的生物芯片技術(shù)平臺點樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片現(xiàn)在是21頁\一共有67頁\編輯于星期三基因芯片的探針現(xiàn)在是22頁\一共有67頁\編輯于星期三TaggedRNAfragmentsflushedoverarrayLaseractivationoffluorescenttagsOpticalscanningofhybridizationintensities基因芯片的雜交實驗現(xiàn)在是23頁\一共有67頁\編輯于星期三Experimentaloverview:HybridizationWashingScancy5channelScancy3channel“Overlayimages”Quantifypixelintensities.CellpopulationACellpopulationBRNAextractionAABBReversetranscriptionAABBKlenowlabelincorporationSampleBlabelledwithcy3dyeSampleAlabelledwithcy5dye現(xiàn)在是24頁\一共有67頁\編輯于星期三Cy3和Cy5Cy3激發(fā)波長532nmCy5激發(fā)波長635nm現(xiàn)在是25頁\一共有67頁\編輯于星期三圖像掃描Cy5Cy3現(xiàn)在是26頁\一共有67頁\編輯于星期三歸一化現(xiàn)在是27頁\一共有67頁\編輯于星期三LimitofDetection:1in30,000transcripts

~20transcripts/cellRed–increaseofCy5sampletranscriptsGreen–increaseofCy3sampletranscriptsYellow–equalabundance現(xiàn)在是28頁\一共有67頁\編輯于星期三差異基因篩選原理：采用cy3/cy5的ratio值對差異基因進(jìn)行判斷，或采用統(tǒng)計方法對差異基因進(jìn)行統(tǒng)計推斷。方法：倍數(shù)法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5Z值法：Z=(X-μ)/σ

作用：發(fā)現(xiàn)兩個樣本間的差異表達(dá)基因，便于后續(xù)分析。現(xiàn)在是29頁\一共有67頁\編輯于星期三MicroarrayandGeneChipApproachesAdvantages:RapidMethodanddataanalysiswelldescribedandsupportedRobustConvenientfordirectedandfocussedstudiesDisadvantages:ClosedsystemapproachDifficulttocorrelatewithabsolutetranscriptnumberSensitivetoalternativesplicingambiguities現(xiàn)在是30頁\一共有67頁\編輯于星期三現(xiàn)在是31頁\一共有67頁\編輯于星期三高通量測序高通量測序技術(shù)（High-throughputsequencing）是指能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，每一次序列測定的讀長一般較短的測序技術(shù)。

高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)?，F(xiàn)在是32頁\一共有67頁\編輯于星期三現(xiàn)在是33頁\一共有67頁\編輯于星期三高通量測序中重要名詞解釋1、測序深度：測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因組大小為7M，測序總堿基數(shù)為70M，則測序深度為10×。2、覆蓋度：測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中高GC含量，重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝的序列往往無法覆蓋所有的區(qū)域，這些區(qū)域就叫做Gap。二者的關(guān)系：測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關(guān)的關(guān)系，測序帶來的錯誤率或假陽性結(jié)果會隨著測序深度的提升而下降。當(dāng)測序深度在10～15X以上時，基因組覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。現(xiàn)在是34頁\一共有67頁\編輯于星期三3、RPKM（readsperkilobasepermillionreads）是每百萬讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數(shù)。其公式為:

其中，totalexonreads指映射到某個基因上的reads數(shù)，mappedreads指map到所有基因的總的reads數(shù)。RPKM不僅對測序深度作了歸一化，而且對基因長度也作了歸一化，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達(dá)水平估計值具有了可比性，是目前最常用的基因表達(dá)估計方法。現(xiàn)在是35頁\一共有67頁\編輯于星期三基于illumina測序的轉(zhuǎn)錄組分析：

RNA-seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是36頁\一共有67頁\編輯于星期三TotalRNA樣品檢測

Agilent2100檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

現(xiàn)在是37頁\一共有67頁\編輯于星期三第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復(fù)↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓

文庫制備↓↓現(xiàn)在是38頁\一共有67頁\編輯于星期三cDNA:為具有與某RNA鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA即complementaryDNA之縮寫。以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。cDNA文庫現(xiàn)在是39頁\一共有67頁\編輯于星期三真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過磁珠吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中?，F(xiàn)在是40頁\一共有67頁\編輯于星期三mRNA反轉(zhuǎn)錄純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀酶切產(chǎn)物。現(xiàn)在是41頁\一共有67頁\編輯于星期三末端修復(fù)cDNA3′末端加AAdapter連接現(xiàn)在是42頁\一共有67頁\編輯于星期三不同方法比較現(xiàn)在是43頁\一共有67頁\編輯于星期三OHFlowCell接頭diol

P7

P5

dioldiol模板雜交dioldiol

延長dioldiol

變性堿基片段雜交現(xiàn)在是44頁\一共有67頁\編輯于星期三CTAGCTA5’-3’-…-5’GT

合成第一個堿基Cycle1:按順序加入反應(yīng)試劑

清除未反應(yīng)的堿基和試劑

激發(fā)堿基熒光并收集熒光信號去除阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán)Cycle2-n: 重復(fù)前面的步驟GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS測序技術(shù)現(xiàn)在是45頁\一共有67頁\編輯于星期三Clusterstation剩下的復(fù)制鏈其一端“固定”在芯片上，另外一端隨機(jī)和附近的另外一個引物互補(bǔ)，被“固定”住，形成“橋”(bridge)。形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴(kuò)增引物，在芯片表面進(jìn)行擴(kuò)增，形成雙鏈。雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，并作為下一輪擴(kuò)增的模板繼續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。反復(fù)若干輪擴(kuò)增，每個單分子得到了大量擴(kuò)增，成為單克隆“DNA簇群”。現(xiàn)在是46頁\一共有67頁\編輯于星期三生物信息分析現(xiàn)在是47頁\一共有67頁\編輯于星期三基因表達(dá)聚類分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的應(yīng)用導(dǎo)致基因表達(dá)數(shù)據(jù)爆炸性增長。如何對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中提取有意義的生物學(xué)信息，已成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究熱點和技術(shù)瓶頸。聚類分析技術(shù)能將待處理的對象分配到相應(yīng)的聚類中，使得同一聚類中的對象差別較小，不同聚類之間的對象差別較大。聚類分析技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，非常適合大批量分析基因群的功能。

現(xiàn)在是48頁\一共有67頁\編輯于星期三基因表達(dá)聚類的數(shù)據(jù)表現(xiàn)Systematicvariationingeneexpressionpatternsinhumancancercelllines.

Nature,2000,Rossetal.現(xiàn)在是49頁\一共有67頁\編輯于星期三現(xiàn)在是50頁\一共有67頁\編輯于星期三現(xiàn)在是51頁\一共有67頁\編輯于星期三有參考基因組序列信息分析流程現(xiàn)在是52頁\一共有67頁\編輯于星期三Reads在基因組上的分布現(xiàn)在是53頁\一共有67頁\編輯于星期三基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化(Nagalakshmi,U.etal.,2008)

通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出酵母3’和5’UTR區(qū)域現(xiàn)在是54頁\一共有67頁\編輯于星期三

鑒定基因可變剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA現(xiàn)在是55頁\一共有67頁\編輯于星期三鑒定融合基因現(xiàn)在是56頁\一共有67頁\編輯于星期三新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)Reads現(xiàn)在是57頁\一共有67頁\編輯于星期三NEngJMed2009SNP分析現(xiàn)在是58頁\一共有67頁\編輯于星期三DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolution

revealshighcomplexityofthericetranscriptomeGenomeRes2010RiceTranscriptomeMaterial

callus

rootatseedlingstage（14d）

shootatseedlingstage（14d）

flagleaves（2stages）

panicle（3stages）Methods

RNASeq（paired-end&singleend）

DGE

smallRNA（18-30nt