包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)

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二、包涵體的洗滌1、包涵體的洗滌問題

尋常的洗滌方法一般是洗不清白的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到適合的濃度，你可以找到一個適合去除雜質(zhì)的方法，其實(shí)這就是梯度沉淀的方法，我覺得比尋常的直接洗脫效果好。

包涵體一般難溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑電泳對比，由于有時候難溶解的就是你的目標(biāo)蛋白，所以每次處理都要把上清和沉淀跑電泳對比，免得把目標(biāo)蛋白弄丟了。

此外剛處理完的包涵體好溶解。冷凍后難溶解，溶解也需要長點(diǎn)時間，也需要大量的溶劑。假使說是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比較純的包涵體

對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。

包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細(xì)菌成分,如一些外膜蛋白、質(zhì)粒ＤＮＡ和其它雜質(zhì)。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇等反復(fù)屢屢進(jìn)行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強(qiáng)度升高而加強(qiáng)，在洗滌包涵體時可加50mMNaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達(dá)50%以上，而且可保持元結(jié)構(gòu)。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3mM。去垢劑如TritonX-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質(zhì),這一步很重要,由于大腸桿菌外膜蛋白OmpT(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復(fù)性過程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解。對于尿素和鹽酸胍的選擇：

尿素和鹽酸胍屬中強(qiáng)度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，故目前已被廣泛采用。

鹽酸胍溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀和對蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾等缺點(diǎn)。

包涵體最終的純化，一般是離子交換，疏水，或者是親和層析，親和層析特別是金屬螯合層析用得比較廣泛，而純化的效果也不錯，尋常是一步就能達(dá)到純度為95%以上的包涵體。

8M高濃度尿素溶解后離心獲得的包涵體溶解液，放在4度冰箱過夜后出現(xiàn)沉淀，這種現(xiàn)象我也在試驗(yàn)中遇到過;開始感覺很奇怪，后來發(fā)現(xiàn)是我們的冰箱的溫控出了問題試驗(yàn)

三、關(guān)于包涵體的溶解：1、請教GST包涵體溶解

2、包涵體的溶解

十二烷基肌氨酸鈉與十二烷基肌氨酸在溶解包涵體時，可不可以相互代替？可以替換，調(diào)pH不久沒什么區(qū)別了嗎；兩者的功能團(tuán)一致，pH不同，前者鈉鹽便于保存罷了3、有關(guān)包涵體的溶解問題強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl6M），是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，由于鹽酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長期保溫時。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分開的包涵體中尋常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需參與還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。4、8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存?我在4度放了半個月，目前沒出什么問題

5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問題?

BI溶液在室溫放置48小時，可能會對目的蛋白有影響，由于尿素在堿性條件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些處理BI溶液比較好。具體有什么影響我也不是很明白。

做完裂解之后加TritonX－100輕搖３０min，蛋白溶解的會多些四、包涵體的復(fù)性1、包涵體如何復(fù)性

包涵體的復(fù)性主要有兩種方式：

1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑

其中透析很適合試驗(yàn)室應(yīng)用，但是時間長。另外，假使蛋白質(zhì)右兩個以上的2硫鍵，很可能錯誤形成配對，應(yīng)用還原劑。還有，復(fù)性的具體方法還要根據(jù)前期試驗(yàn)及篩選來確

包涵體的復(fù)性還要注意以下幾點(diǎn)：

1.首先要獲得較高純度的包涵體。

2.包涵體溶解要完全，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不

要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。3.透析前后均要離心4.透析不能太快.

5.純化的最正確條件要摸索。小技巧：

1）包含體要完全洗滌清白，洗滌液中參與適量Triton-X100.

2)包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性3）復(fù)性液的組成很有講求，本人使用OxidisedGlutathione/ReducedGlutathione還參與一定的L-Arginine-Hydrochloride12-24h4)復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h

5)復(fù)性率的測定據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測定（望有經(jīng)驗(yàn)的戰(zhàn)友能更詳細(xì)地講解）

6）TritionX100、SDS這一類去垢劑最終不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。好像SDS最終殘留量不能大于0.5%吧，忘了。

我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng)條件，再洗滌包涵體，有時可以在上柱前已經(jīng)只剩下3-4條雜帶，這樣后續(xù)的純化就很便利了。由于色譜柱的純化條件比較難optimize。這段文字可以參考：

用Novagen公司《pETSystemManual》提供的方法，分別進(jìn)行細(xì)菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細(xì)胞周質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)和包涵體中的分布。滲透休克用1.2.3方法誘導(dǎo)細(xì)菌（10ml體積），測菌液OD600，10000r/min離心0.5min去上清，參與滲透休克溶液1（V1=OD600×V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養(yǎng)新鮮菌液），冰浴10min，10000r/min離心0.5min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動冰浴10min，10000r/min離心0.5min，保存上清、細(xì)菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCATrichloroaceticacid)沉淀，加1/10體積100%TCA(w/v)，渦漩15sec.，冰浴10min，13000r/min離心5min，100ul丙酮洗滌沉淀，枯燥1h，加V1/2體積1×PBS（pH10）溶解，-20℃保存，取10ul參與等體積2×SB，進(jìn)行12%SDS電泳分析，UNIUERSALHooD-S.N.75s成像系統(tǒng)照相。

超聲波裂解細(xì)菌滲透休克細(xì)菌沉淀加1/10培養(yǎng)體積20mMTris-HCl（pH7.5，0℃）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈沖粉碎1min，然后13000r/min離心5min，-20℃保存上清、細(xì)菌沉淀。上清進(jìn)行TCA沉淀，處理同上。沉淀用ProteinExtractionReagent（Ni-NTAHiBindPurificationKitBugBuster.提供）按Novagen公司《pETSystemManual》提供方法反復(fù)處理，洗滌包涵體。包涵體按培養(yǎng)菌100×OD600/3ul體積加1%SDS溶解，加等體積2×SB，進(jìn)行12%SDS電泳分析，進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描，計算融合蛋白Trx-PrPC27-30占細(xì)菌總蛋白的相對含量。1.2.7重組融合蛋白的純化

PrP-pET-32a（+）轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliBL21（DE3），TB培養(yǎng)基中，25℃，AMP200ug/ml，搖床（250r／min）培養(yǎng)至OD600約為1.5，更換等體積新鮮TB培養(yǎng)基，參與IPTG至終濃度1mM，AMP200ug/ml，25℃，4h，4000g離心收集菌體。按Ni-NTAHiBindPurificationKit使用說明溶解包涵體，純化融合蛋白。

或使用筆者改進(jìn)方法，將Ni-NTAHiBindPurificationKit使用說明中BufferD改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最終用Buffer-E重生Ni-NTAHiBindRasin，Binding-Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免長菌。

洗脫所得蛋白用TCA沉淀，處理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，凍干保存。然后12%SDS凝膠電泳分析。

3、包涵體復(fù)性2

精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對人可能不好。

另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。

對于疏水蛋白的可溶表達(dá)，可以降低誘導(dǎo)溫度（可以試試4度誘導(dǎo)過夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達(dá)速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量?；蛘邠Q成GST融合表達(dá)載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達(dá)。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復(fù)性過程中，在透析液中參與了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對于你的狀況，由于含有二硫鍵，還要參與一定比例的谷胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。復(fù)性是一個很難捉摸的過程，不同蛋白的復(fù)性條件也各不一致。5、包涵體復(fù)性問題包含體復(fù)性三大原則：1。低濃度2。平緩梯度3。低溫

有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。此外，透析的鹽濃度（譬如ura）要平緩降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。6、包涵體復(fù)性形成聚集物

關(guān)鍵是蛋白在復(fù)性過程中凝聚了以后，調(diào)理PH可以使其溶解，但是這樣復(fù)性好的蛋白有沒有活性還是問題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒有也不行呀！

7、復(fù)性中蛋白析出！

出現(xiàn)蛋白析出，確定是條件變化太猛烈了。復(fù)性應(yīng)當(dāng)采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)你包含體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必需濃度極低，條件溫柔，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)當(dāng)很低。

若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油；一些拙見。8、包涵體復(fù)性液配方

對于包涵體復(fù)性，一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M左右時終止。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時復(fù)性過程已經(jīng)終止。TRIS系統(tǒng)和PBS系統(tǒng)都沒有明確的規(guī)定，這些需要你在試驗(yàn)過程中不斷試驗(yàn)，確定適合的緩沖系統(tǒng)；不過復(fù)性過程主要是注意以下幾個問題：1）最適pH值范圍為8.0-9.0之間；2)溫度適合選擇4℃；

3）復(fù)性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL；4)復(fù)性時間一般為24-36小時；

5)低分子化合物