核酸分子雜交優(yōu)秀公開(kāi)課

現(xiàn)代分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三

總RNA的提取與Northern雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参锟俁NA的提取及凝膠電泳檢測(cè)的原理及方法并能熟練操作對(duì)于不同的植物組織，選取不同的提取方法，提取植物的總RNA重點(diǎn)掌握Northern雜交基本原理、基本實(shí)驗(yàn)步驟和檢測(cè)方法利用Northern雜交檢測(cè)目的基因的時(shí)空表達(dá)情況，如不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、不同的組織部位、不同生長(zhǎng)環(huán)境等條件下相關(guān)基因的表達(dá)情況植物總RNA的提取及電泳檢測(cè)掌握植物總RNA的提取及凝膠電泳檢測(cè)的原理掌握植物總RNA提取的方法并熟練操作用甲醛變性凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)總RNA提取質(zhì)量對(duì)于不同的植物組織，選取不同的提取方法，提取植物的總RNA實(shí)驗(yàn)設(shè)備常規(guī)設(shè)備移液器，tip頭，離心機(jī)RNA電泳金屬浴，水平凝膠電泳儀，微波爐，紫外凝膠成像系統(tǒng)紫外分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)試劑RNA提取液100mmol/LTris–ClpH8.520mmol/LEDTApH8.50.2MNaCl1%SDSβ-巰基乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇瓊脂糖、MOPS、EB替代品實(shí)驗(yàn)步驟新鮮植物材料液氮研磨抽提液混勻酚/氯仿抽提水層

中間層

有機(jī)層加入異丙醇沉淀干燥水融反復(fù)抽提五、實(shí)驗(yàn)步驟RNA濃度測(cè)定取1ulRNA樣品，加水199ul后讀取260nm處的吸光度值260nm處的吸光度值相當(dāng)于40μg/ml單鏈RNA，以此來(lái)計(jì)算樣品含量。260nm和280nm讀數(shù)比值（A260/A280）可反映核酸的純度純品的A260/A280的值為2.0，低于A260/A280，有蛋白質(zhì)或酚的污染。實(shí)驗(yàn)步驟RNA電泳RNA變性處理1ulRNA樣品加入2.5ul上樣緩沖液，混勻后65℃溫育5-10min置于冰上冷卻（20ulRNA+50ul上樣緩沖液）檢測(cè)RNA的凝膠要配制MOPS甲醛電泳緩沖液為1×M0PS

注意事項(xiàng)特別要注意的是在所有器具嚴(yán)格消毒，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要帶手套，減少說(shuō)話和走動(dòng)等防止RNase的污染，來(lái)保證RNA不被降解。分子雜交核酸分子雜交，其中又包括Southern雜交及Northern雜交。屬于蛋白質(zhì)分子“雜交”的Western雜交。核酸分子雜交是指非同一分子來(lái)源但具有互補(bǔ)序列(或某一區(qū)段互補(bǔ))的兩條多核苷酸鏈，通過(guò)Watson—Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程。雜交的雙方是待測(cè)核酸及探針（probe）待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因組DNA或總RNA被人為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過(guò)某種特定方法檢出，即成為所謂的探針。實(shí)驗(yàn)原理－分子雜交分子雜交是進(jìn)行核酸序列分析，重組子鑒定，及檢測(cè)外源基因整合及表達(dá)的強(qiáng)有力的手段。要證明外源基因在植物染色體上整合的最可靠的方法是，只有經(jīng)分子雜交鑒定過(guò)的植物才可以稱為轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí)也可以利用Northern雜交來(lái)檢測(cè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同的組織部位相關(guān)基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)原理－分子雜交Northern雜交是以DNA或RNA為探針，檢測(cè)RNA鏈，用于外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異mRNA的檢測(cè)。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上，將它們?cè)晦D(zhuǎn)移到固相膜上，在適宜的離子強(qiáng)度及溫度下，探針與膜上同源序列雜交，形成RNA-DNA雜交雙鏈。利用探針中的digoxigenin和anti-digoxigenin-Ap抗體結(jié)合，再通過(guò)堿性磷酸酶AP與CDP-star底物作用，檢測(cè)CDP-star的化學(xué)發(fā)光間接進(jìn)行定量分析。若經(jīng)雜交，樣品中無(wú)雜交帶出現(xiàn)，表明雖然外源基因已經(jīng)整合到植物細(xì)胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下該基因并未有效表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)原理－Northern雜交實(shí)驗(yàn)原理－RNA提取細(xì)胞破碎，核酸溶出液氮速凍后，對(duì)植物組織進(jìn)行研磨可以破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液可溶出核酸。核酸的純化DNA的去除酚、氯仿抽提使蛋白質(zhì)變性、沉淀，可去除蛋白。多糖、次生代謝物核酸的保護(hù)（內(nèi)源RNA酶）低溫、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保護(hù)RNA不被酶解。堿性磷酸酶OPO3HPO4OO目標(biāo)mRNASpacerDigoxigenin探針Anti-DigoxigeninAntibodyDigoxigeninHaptenAlkalinephosphataseCDP-Star不穩(wěn)定中間產(chǎn)物分解發(fā)光

Northern雜交使用了生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記檢測(cè)是以DIG-dUTP為底物，用隨機(jī)摻入法進(jìn)行DNA標(biāo)記，PCR合成標(biāo)記有地高辛的探針，然后加入抗地高辛（DIG）堿性磷酸酶復(fù)合物Anti-DIG-AP的抗體，利用堿性磷酸酶和化學(xué)底物作用檢測(cè)到雜交的靶DNA。

實(shí)驗(yàn)原理－信號(hào)檢測(cè)核酸分子雜交又可分為核酸在體外與探針雜交（膜上印跡雜交）在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雜交（細(xì)胞原位雜交）分子雜交可以在液相及固相中進(jìn)行，目前實(shí)驗(yàn)室中廣泛采用的是在固相膜上進(jìn)行的固－液雜交。膜上印跡雜交將待測(cè)的DNA或RNA分子經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后原位轉(zhuǎn)移到固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上雜交液（液相）中的探針與印跡到固相膜上的特異片段發(fā)生雜交實(shí)驗(yàn)原理分子雜交的實(shí)驗(yàn)涉及到的三項(xiàng)技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)印跡技術(shù)分子雜交技術(shù)分子雜交的實(shí)驗(yàn)涉及到的三大內(nèi)容制備被檢的核酸或蛋白質(zhì)樣品(或標(biāo)本)制備雜交探針印跡及雜交實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑RNA提取液（TSE）100mmol/LTris-ClpH8.520mmol/LEDTApH8.5200mmol/LNaCl1%SDSPVPP、β-巰基乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇瓊脂糖、MOPS、EB20×SSC:3mol/LNaCl，1.3mol/L檸檬酸鈉（PH7.0）鮭精DNA雜交液：7%SDS，50mmol/LNa3PO4（pH7.0），2%blockingstocksolution，5×SSC，50％甲酰胺，0.1%SodiumN-lauroylSarcoineBufferI:0.1mol/Lmaleicacid，0.15mol/LNaCl（pH7.5）BufferII:10%blockingstocksolution(Anti-dig)BufferIII:

0.1mol/LTris，0.1mol/LNaCl(pH9.5)

(CDP-star)Washing1：2×SSC，0.1%SDSWashing2：0.1×SSC，0.1%SDS顯影液、定影液實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)步驟－RNA提取植物材料液氮研磨抽提液混勻酚/氯仿抽提水層

中間層

有機(jī)層加入異丙醇沉淀干燥水融反復(fù)抽提實(shí)驗(yàn)步驟－RNA提取向1.5mL離心管中加入700LRNA提取液，35μL的β-巰基乙醇（終濃度5%），適量PVPP。取適量材料，在液氮充分研磨成粉末后，裝入離心管中，用力充分混勻。加入苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）各350μL，混勻10min，4℃8000rpm離心10min。取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），搖床震蕩10min，4℃8000rpm離心10min。取上清，加入等體積的異丙醇和1/2體積的1.2mol/LNaCl，充分混勻。-20℃放置30min后4℃，12000rpm離心10min。棄上清，70%乙醇洗沉淀，離心，4℃12000rpm離心5min。棄上清，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥沉淀。沉淀溶于20μL滅菌水中，備用。實(shí)驗(yàn)步驟－RNA濃度檢測(cè)RNA濃度測(cè)定取1ulRNA樣品，加水199ul后讀取260nm處的吸光度值260nm處的吸光度值相當(dāng)于40μg/ml單鏈RNA，以此來(lái)計(jì)算樣品含量。260nm和280nm讀數(shù)比值（A260/A280）可反映核酸的純度純品的A260/A280的值為2.0，低于A260/A280，有蛋白質(zhì)或酚的污染。實(shí)驗(yàn)步驟－RNA濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟－RNA電泳RNA變性處理1ulRNA樣品加入2.5ul上樣緩沖液，混勻后65℃溫育5-10min置于冰上冷卻檢測(cè)RNA的凝膠配制MOPS甲醛電泳緩沖液為1×M0PS

用透明膠帶將膠板的兩端封好。配制0.8%的瓊脂糖凝膠（0.16g瓊脂糖于50ml三角瓶中，加入1×MOPS20ml），在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。10×MOPS（MOPS0.2M，NaAC50mM，EDTA10mM，

pH7.0）待溶液冷卻至60℃左右，加入1ml甲醛，2ul溴化乙錠充分混勻。放置合適大小的梳子，將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠模中，凝膠厚度在3-5mm之間，大約需要凝固20min。實(shí)驗(yàn)步驟－RNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟－Northern雜交流程1234567實(shí)驗(yàn)步驟RNA濃度的測(cè)定及調(diào)整對(duì)提取的總RNA進(jìn)行含量測(cè)定（CTAB法）。根據(jù)測(cè)定的吸光度(A260)進(jìn)行濃度的調(diào)整和稀釋（OD260×40μg/ml)

。一般調(diào)節(jié)總RNA的濃度到1ug/uL。要求上樣量一致。電泳制備大板膠。用15ug樣品進(jìn)行甲醛變性膠電泳(0.8%瓊脂糖凝膠)，電壓為50V，5h，低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳，使各分子量的mRNA充分分開(kāi)。紫外凝膠成像檢測(cè)電泳效果。轉(zhuǎn)膜將電泳好的膠，切去上樣孔、兩邊至合適的大小，放于用20×SSC潤(rùn)濕的，無(wú)氣泡的普通濾紙上，依次放上與膠等大的醋酸纖維膜，3MM濾紙，用玻璃棒或試管輕輕地趕氣泡。用封口膜封邊，放上疊好的吸水紙，壓上約1000g的重物。烘干轉(zhuǎn)膜過(guò)夜后，取出尼龍膜，用鉛筆標(biāo)記上樣孔、編號(hào)，置于50℃烘干30min。交聯(lián)短波紫外線固定30s。核酸分子中的部分胸腺嘧啶殘基與膜上帶正電荷的氨基基團(tuán)相互交聯(lián)，從而使結(jié)合更加牢固預(yù)雜交使非特異性DNA分子及其它高分子化合物不與待測(cè)的RNA分子雜交，從而使待測(cè)的RNA分子在雜交時(shí)能與探針進(jìn)行特異性結(jié)合。鮭精DNA100℃，變性5min，之后冰上備用將結(jié)合了RNA的硝酸纖維素膜置于雜交袋內(nèi)并加入5ml預(yù)雜交液，25ul變性好的鮭精DNA，排除袋內(nèi)的氣泡后，封口，50℃恒溫水浴，震蕩1h。雜交在預(yù)雜交袋中加入變性好的的探針5uL，趕氣泡，封袋，50℃水浴震蕩過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟－轉(zhuǎn)膜

實(shí)驗(yàn)步驟－轉(zhuǎn)膜瓊脂糖凝膠醋酸纖維素膜

預(yù)雜交buffer中含有‘blockingreagents’能占據(jù)膜上的可結(jié)合位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟－雜交實(shí)驗(yàn)步驟－加入抗體Anti-Dig實(shí)驗(yàn)步驟－加入發(fā)光底物CDP-STAR實(shí)驗(yàn)步驟－洗膜X光片的曝光將封好的膜放在暗盒中，暗室中在其上放置好X光片，蓋好暗盒，X光片曝光45min。顯影液、定影液沖洗X光片。觀察、分析雜交結(jié)果。實(shí)驗(yàn)步驟－信號(hào)檢測(cè)注意事項(xiàng)RNA提取中要特別注意防止RNA的降解。注意器具的消毒，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中帶手套，減少說(shuō)話和走動(dòng)等防止RNase的污染，來(lái)保證RNA不被降解。準(zhǔn)確調(diào)節(jié)總RNA的濃度，保證上樣的質(zhì)、量。低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳，以保證雜交質(zhì)量。轉(zhuǎn)膜時(shí)應(yīng)該使所有的RNA分子都轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，才能夠保證雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。掌握紫外固定的時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成核酸的斷裂。保證雜交時(shí)間和探針的加入量。保證洗膜的質(zhì)量，保證雜質(zhì)的洗脫。嚴(yán)格控制曝光時(shí)間以得到清晰的雜交結(jié)果。作業(yè)按要求認(rèn)真撰寫報(bào)告，包