微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(用)

微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(用)第1頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

到目前為止，幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)第2頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四你知道微生物可分為哪幾類嗎？第3頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲、單細(xì)胞藻類等微生物包含了除植物界和動(dòng)物界以外的所有生物無細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).第4頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第5頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基作用、種類二、無菌技術(shù)三、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基四、純化大腸桿菌本課題主要內(nèi)容第6頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基

人們按照微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基1什么是培養(yǎng)基？培養(yǎng)基的基本成分有哪些？第7頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基

一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無機(jī)鹽和水以及特殊營養(yǎng)（即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶）等。同時(shí)培養(yǎng)基要滿足微生物對(duì)氧氣及pH值的要求。培養(yǎng)基的基本成分第8頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

液體培養(yǎng)基：（一般用錐形瓶盛裝）

固體培養(yǎng)基：（一般用試管或培養(yǎng)皿盛裝，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加瓊脂。）

2培養(yǎng)基可分為哪些種類？（1）、按物理狀態(tài)分：（2）、按功能分：選擇培養(yǎng)基：加入某種化學(xué)物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物鑒別培養(yǎng)基：加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物第9頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第10頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四部分實(shí)驗(yàn)試劑牛肉膏蛋白胨瓊脂第11頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)基：菌落第12頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四什么是菌落？

由單個(gè)細(xì)菌或幾個(gè)細(xì)菌在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見的子細(xì)胞群落。第13頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四不加氮源的無氮培養(yǎng)基:不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:

你能舉幾種選擇培養(yǎng)基嗎？分離固氮菌

分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為尿素的培養(yǎng)基分解尿素的細(xì)菌第14頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四1什么是無菌技術(shù)？

無菌技術(shù)泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。

獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，無菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。二、無菌技術(shù)第15頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3、什么是消毒？常用的消毒方法有哪些？

2、你知道無菌技術(shù)有哪些種類？

使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對(duì)人體有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）消毒和滅菌煮沸消毒、巴氏消毒法、化學(xué)藥劑消毒。第16頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四4、什么是滅菌？滅菌的方法有哪些？使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌第17頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四5、微生物實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)哪些進(jìn)行消毒？哪些進(jìn)行滅菌？如何避免雜菌污染？

對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔消毒；將培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。接種的過程要在酒精燈火焰附近進(jìn)行；避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸。第18頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基三、實(shí)驗(yàn)操作1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟有哪些？計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板第19頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四1.計(jì)算：物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL

準(zhǔn)確稱取各種成分，注意事項(xiàng)：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速，稱后及時(shí)蓋上瓶蓋。2.稱量第20頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3.溶化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加自來水定溶至100mL。

4.滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3～5套，用幾層報(bào)紙包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時(shí)倒平板。第21頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

5.倒平板的具體操作過程是怎樣的？第22頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四6、請(qǐng)思考并回答倒平板操作的討論？

（1）.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時(shí)倒平板。用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？

用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時(shí)即可開始倒平板。

（2）.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第23頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。第24頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。第25頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四（二）純化大腸桿菌

微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。1、微生物接種方法有哪些？第26頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。

在數(shù)次劃線后可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落。2.什么是平板劃線法？平板劃線法如何操作？第27頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況第28頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況第29頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

（1）、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)？

第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。3、平板劃線法的討論第30頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四（2）.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。第31頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四4.什么是稀釋涂布平板法？

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。

在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。

稀釋涂布平板法操作過程分兩個(gè)步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。第32頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四6、系列稀釋操作是怎樣操作的？101102103104105106

(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號(hào)。

(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。

(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復(fù)步驟2，直至到第六支試管。第33頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四7、涂布平板操作是怎樣進(jìn)行的？(1)將涂布器浸在盛有70％的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻8～10s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。第34頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四稀釋涂布平板法獲取的菌落第35頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)基：菌落菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)第36頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌的菌落有鞭毛細(xì)菌：無鞭毛細(xì)菌：有莢膜細(xì)菌：無莢膜細(xì)菌：菌落光滑,S型菌落粗糙,R型大而扁平，邊緣波狀或鋸齒狀。較小較厚，邊緣整齊。第37頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四思考：涂布平板操作討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。

將接種后和未接種（作為對(duì)照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果。第38頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨(dú)立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)第39頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同。隨著時(shí)間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請(qǐng)分析其可能的原因。

無菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時(shí)發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。第40頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四

1.試管低溫臨時(shí)保藏

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6個(gè)月要重新接種培養(yǎng)后再保存）。

2.甘油管長期保藏

在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷凍箱中保存。五、課題延伸---菌種的保藏第41頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四芽孢:

有些細(xì)菌（多為桿菌）在一定條件下，細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的球形或橢圓形的休眠體。

孢子:

細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個(gè)體.第42頁，共44頁，2023年，2月20日，星期四消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源第43