海洋生物活性物質(zhì)活性蛋白肽氨基酸

魚(yú)精蛋白是存在于許多魚(yú)類的成熟精細(xì)胞中的一種堿性蛋白，分子量較小，大約為4000~10000，精氨酸占其氨基酸組成的三分之二以上

（一）海洋生物活性蛋白1、魚(yú)精蛋白現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

魚(yú)精蛋白的結(jié)構(gòu)

魚(yú)精蛋白的結(jié)構(gòu)因魚(yú)種不同而有差異，但是它們存在許多相似的特征，如N-端均為精氨酸或者丙氨酸，各種魚(yú)精蛋白分子肽鏈中都含有4個(gè)較長(zhǎng)的和2個(gè)較短的精氨酸簇，并且分別被特征性的殘基Ser或Thr，Pro-Ile，Gly-Gly或Val-Val分隔開(kāi)。以鮭魚(yú)魚(yú)精蛋白為例，其氨基酸的序列如下：

Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Val-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg

現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四魚(yú)精蛋白的抗菌譜及其最小抑菌濃度

魚(yú)精蛋白的抗菌譜

菌種鯡精蛋白鮭精蛋白PseudomonasfluorescensSerratiamarcesensProteusmorganiiEscherichiacoliSalmonellaenteritidisVibrioparahaemolyticusEnterobacterareogenesStaphylococcusaureusBacilluscoagulans

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+++產(chǎn)氣腸桿菌金色葡萄球菌芽孢型乳酸菌C菌1931年McClean首先報(bào)道了魚(yú)精蛋白具有抑菌活性現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四魚(yú)精蛋白的抗菌譜菌種鯡精蛋白鮭精蛋白B．Megaterium：巨大芽孢桿菌B．Licheniformis：地衣芽孢

B．SubtilisruberB．Subtilisniger枯草芽孢桿菌

B.Subtilismesentericus馬鈴薯芽孢桿菌

Lactobacillusplantarum胚芽乳桿菌

Lactobacilluscasei干酪乳桿菌

Streptococcusfaecalis糞鏈球菌

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++在中性和堿性條件下，對(duì)耐熱芽孢菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌作用，PH值7～9時(shí)最強(qiáng)，對(duì)熱穩(wěn)定(120℃，30min)。

現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

魚(yú)精蛋白的抗菌機(jī)理

研究表明，魚(yú)精蛋白主要是以分子中多聚精氨酸或多聚精氨酸與其他少數(shù)幾個(gè)氨基酸以某種結(jié)構(gòu)或形式與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合，破壞細(xì)胞壁中的肽聚糖的合成，從而達(dá)到抑菌的效果。

魚(yú)精蛋白的抗菌性會(huì)受到很多因素的影響，比如食品的pH值、金屬離子、有機(jī)成分、溫度和時(shí)間等

現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

魚(yú)精蛋白的臨床藥理作用

魚(yú)精蛋白具有強(qiáng)堿性基團(tuán)，在體內(nèi)可與強(qiáng)酸性的肝素結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使肝素失去抗凝能力。尚具有輕度抗凝血酶原激酶作用，臨床一般不用于對(duì)抗非肝素所致抗凝作用。現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四魚(yú)精蛋白的安全性

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)、蓄積毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)、小鼠睪丸染色體畸變實(shí)驗(yàn)等的結(jié)果表明，魚(yú)精蛋白的LD50＞10g/kg，蓄積系數(shù)K＞

5，對(duì)雄性小鼠骨髓微核率沒(méi)有增加作用，對(duì)小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體沒(méi)有致畸作用。采用Ames法對(duì)魚(yú)精蛋白的致突變性進(jìn)行了試驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)其具有致突變作用?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四（1）來(lái)源藍(lán)藻（Cyanophyceae）、紅藻（Rhodophyceae）、隱藻（Cryptophyceae）和少數(shù)一些甲藻（Pyrrophyceae）中，它是藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、藻紅藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的總稱。按照光譜類型來(lái)分類，藻膽蛋白則可以分為六大類：異藻藍(lán)蛋白B（APB）、異藻藍(lán)蛋白（AP）、藻藍(lán)蛋白（PC）、藻紅藍(lán)蛋白（PEC）、藻紅蛋白I（PEI）和藍(lán)藻中含藻尿膽素的藻紅蛋白Ⅱ（PEⅡ）。2、藻膽蛋白螺旋藻的藻藍(lán)蛋白紫球藻的B-藻紅蛋白鹵腥藻和念珠藻的C-藻藍(lán)蛋白微藻藻膽蛋白的研究尤為重要比如藻藍(lán)蛋白在可見(jiàn)光區(qū)620nm的吸收與紫外光區(qū)280nm的吸收之比大于4.5，而異藻藍(lán)蛋白在可見(jiàn)光區(qū)650nm的吸收與紫外光區(qū)280nm的吸收之比大于4.0。現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四（2）藻膽蛋白分子的組成藻膽蛋白是由脫輔基蛋白（載體蛋白）和四吡咯結(jié)構(gòu)的色基（發(fā)色團(tuán)）——藻膽素所組成。發(fā)現(xiàn)所有的色基均是與多肽鏈中的半胱氨酸殘基以硫醚鍵共價(jià)結(jié)合，結(jié)合的方式分別是通過(guò)色基的A環(huán)或者D環(huán)單鏈相連，也有的色基A環(huán)和D環(huán)同時(shí)與脫輔基蛋白相連。在藻膽蛋白的色基分為：藻紅膽素（PEB）、藻藍(lán)膽素（PCB）、藻尿膽素（PUB）。（3）主要特點(diǎn)藻膽蛋白是一種古老的捕光色素蛋白質(zhì)。組成藻膽蛋白的氨基酸發(fā)生了一些特異性修飾，使之免遭蛋白酶的水解。蛋白質(zhì)的一種保護(hù)機(jī)制現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四（4）生理活性1、R-藻紅蛋白可以和胰島素抗體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)，這表明R-藻紅蛋白的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)的某些部位和胰島素有一定程度的相似，可能對(duì)糖尿病有一定的療效。2、藻膽蛋白可以刺激人B-淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，提高機(jī)體的免疫力。3、與血紅素結(jié)構(gòu)相似，在相似消化環(huán)境下，藻藍(lán)蛋白可以和鐵形成可溶性化合物，提高鐵的吸收率。4、從螺旋藻中提取的藻藍(lán)蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明它有極強(qiáng)的抗癌作用，尤其是對(duì)肝癌細(xì)胞。安全無(wú)毒，藻類含量極為豐富，食品色素和化妝品現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四5、藻膽蛋白結(jié)合激光輻射，可以有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。0.25mg/ml藻藍(lán)蛋白處理小白鼠骨髓瘤細(xì)胞，與對(duì)照組相比，激光輻射后細(xì)胞存活率由15%提高到71%，且對(duì)骨髓造血具有刺激作用。提示可用于臨床治療血液病及血癌。低濃度的藻紅蛋白，分別對(duì)人口腔8113癌細(xì)胞和小鼠S180瘤細(xì)胞的殺傷率高達(dá)75%和76%。這種光敏殺傷作用與藻膽蛋白的濃度規(guī)律附合曲線為：（X+0.52）以此可以推導(dǎo)治療中藻膽蛋白用量和調(diào)節(jié)激光能量大小，以發(fā)揮最大的殺傷效能?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四海洋附著生物能永久或暫時(shí)性地黏附于各種固體表面,對(duì)海上生產(chǎn)、運(yùn)輸?shù)榷紟?lái)不小的麻煩。但另一方面,海洋附著生物所分泌的黏附物質(zhì)在水下所展現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)異黏附性能是目前其他的粘合劑所不能取代的。目前主要有兩類：貽貝的足絲蛋白(musselfootprotein)和藤壺膠(Barnaclecement)3、黏附蛋白現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四藤壺屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、蔓足目、藤壺科，是附著在海邊巖石上的一簇簇灰白色、有石灰質(zhì)外殼的小動(dòng)物。藤壺，雖屬甲殼動(dòng)物，但成體卻既不游泳，也不爬行，而是營(yíng)固著生活。

藤壺粘液的粘性甚強(qiáng)，甚至藤壺的化石經(jīng)過(guò)幾千年的滄桑仍牢固地附著在其他物體上。人工合成這種粘液，可用來(lái)補(bǔ)牙，粘接建筑材料（又稱超級(jí)水泥）；還可用來(lái)修船和粘接漏洞；在醫(yī)療上粘合傷口，手術(shù)開(kāi)刀后只需涂上這種粘液即可?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四貽貝屬軟體動(dòng)物門(mén)Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、翼形亞綱Pterimorphia、貽貝目Mytioida、貽貝科貽貝足絲中富含蛋白質(zhì)成分,從外形上可以分為兩部分,足絲纖維(byssus)和足絲盤(pán)(pad)。貽貝的足絲蛋白的粘合力及防水性能極強(qiáng)且無(wú)毒性,是現(xiàn)有任何粘合劑均無(wú)法比擬的,因此在醫(yī)藥、造船、涂料等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四從加州貽貝和紫貽貝足絲中鑒定到至少8種足絲蛋白mfp,

分別為mfp-1～mfp-6、膠原蛋白preColD和preColNG。膠原蛋白主要構(gòu)成貽貝足絲纖維的核心骨架部分并延伸至足絲盤(pán);mfp-1則覆蓋在整個(gè)足絲表面而構(gòu)成足絲的保護(hù)外套,以防止海水的溶解及微生物的降解。mfp-2~mfp-6則主要定位于貽貝的足絲盤(pán),是貽貝足絲用以和外界固體表面形成黏附的主要蛋白成分以上足絲蛋白分子量從5kDa(mfp-3)～240kDa(preCol-D)不等,但仍具有一些相似的理化性質(zhì),例如,它們的等電點(diǎn)相似,均為堿性蛋白(pI>9),并且成熟足絲蛋白大都含有大量的翻譯后修飾的3,4-二羥基苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine,DOPA)?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四MFP-1蛋白貽貝足絲纖維的主要成分,分子量達(dá)到了108kD。一級(jí)結(jié)構(gòu)具有75～80個(gè)串聯(lián)起來(lái)的十肽重復(fù)單元。其序列中通常含有2種修飾性氨基酸——DOPA和羥基脯氨酸。十肽重復(fù)單元是高度親堿和親水性的，且DOPA含量較高，通過(guò)交聯(lián)和絡(luò)合將大量鐵離子變?yōu)閳?jiān)韌而致密的涂層，保護(hù)其結(jié)構(gòu)免受磨蝕和細(xì)菌等微生物的降解。mfp-1的糖基化和羥基化程度均非常高,肽鏈交聯(lián)緊密,所以結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，并且不同來(lái)源的mfp-1在結(jié)構(gòu)上存在較大差異。

mfp-1在貽貝足絲中主要負(fù)責(zé)對(duì)足絲的保護(hù),而非與外界的粘合作用?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四MFP-2蛋白

Mfp-2最早從地中海貽貝Mytilusgalloprovincialis的足絲中分離到,其分子量為45kDa；序列中同樣含有DOPA,但含量較低(5mol%),

一個(gè)重要特征在于其序列中含有大量半胱氨酸因mfp-2主要定位在足絲盤(pán),因此推測(cè)該蛋白可能與足絲盤(pán)黏附蛋白之間形成交聯(lián)有關(guān)?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四MFP-3蛋白Mfp-3的DOPA摩爾分?jǐn)?shù)較高，分子量為5~7kD，無(wú)重復(fù)單元，且富含精氨酸，這些殘基有許多被修飾成4-羥基-L-精氨酸(R)。Mfp-3存在很強(qiáng)的蛋白多態(tài)性現(xiàn)象,例如,在加洲貽貝足絲蛋白中檢測(cè)到mfp-3有20多種,氨基酸殘基從42到54個(gè)不等,序列相似性較高。不同貽貝來(lái)源的mfp-3在其分子量,DOPA含量,序列方面均有有較高的相似性,特別是在其序列的C端,均存在一個(gè)Gly-Trp-Asn-X-Gly-Trp-X(X為L(zhǎng)ys或者Asn)的七肽片段現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四MFP-4蛋白mfp-4也是一種定位于足絲盤(pán)的黏附蛋白,是一類質(zhì)量為93kD的蛋白質(zhì)。mfp-4的序列中有36個(gè)富含組氨酸His(22mol%)的十肽重復(fù)片段;此外Lys、Arg以及Asp的含量也較高;表現(xiàn)在N端和C端分別含有16個(gè)富含Asp的十一肽重復(fù)片段。但DOPA的含量?jī)H2mol%。推測(cè)這類大質(zhì)量的蛋白質(zhì)在足絲附著基中很可能是起穩(wěn)定作用。現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四MFP-5蛋白Mfp-5分子量9kDa左右，含74個(gè)殘基序列中DOPA的摩爾分?jǐn)?shù)達(dá)到30%。Mfp-5中超過(guò)1/3的殘基是翻譯后被羥基化或磷酸化修飾，其中酪氨酸羥基化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镈OPA，或絲氨酸磷酸化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镺-磷酸絲氨酸。研究發(fā)現(xiàn)，因含磷酸絲氨酸的蛋白質(zhì)對(duì)鈣的親和力很強(qiáng)，被修飾后的磷酸絲氨酸有助于貽貝附著在毗鄰的貽貝外殼上，解釋了為何Mfp-5中含有如此高的O-磷酸絲氨酸。研究發(fā)現(xiàn)足絲蛋白的粘合性能與DOPA含量呈正相關(guān)。mfp-3和mfp-5因低分子量和高DOPA含量以及由此表現(xiàn)的強(qiáng)的粘合能力而成為貽貝粘合蛋白研究中最受關(guān)注的兩個(gè)蛋白分子現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四MFP-6蛋白Mfp-6也是一種定位于足絲盤(pán)中的黏附蛋白,分子量11.6kDa序列中含量最豐富的氨基酸是酪氨酸Tyr(20.2mol%),其次是Gly(14.1mol%),Cys的含量也較高(11mol%),且約有1/3的Cys保留了自由的巰基,但DOPA的含量不到5mol%mfp-6與足絲盤(pán)黏附蛋白的固化有很大關(guān)系,它能通過(guò)含自由巰基的半胱氨酸Cys介導(dǎo)足絲盤(pán)黏附蛋白分子中的DOPA之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在是21頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四preColD和preColNG膠原蛋白preColD和preColNG主要構(gòu)成貽貝足絲纖維的核心骨架部分(fibrouscore)并延伸至足絲盤(pán)mfp-4可能負(fù)責(zé)足絲纖維中的膠原蛋白與足絲盤(pán)的黏附蛋白之間的連接,同時(shí)在足絲盤(pán)黏附蛋白之間也發(fā)揮著連接作用?，F(xiàn)在是22頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四糖蛋白(glycoprotein)是指由鏈較短、往往帶分支的寡糖與多肽鏈某些特定部位的羥或酰氨基以共價(jià)鍵形式連接的一類結(jié)合蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)廣泛存在——糖生物學(xué)(glycobiology)。糖蛋白中的糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)的功能起重要修飾作用，如糖鏈影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象、折疊、溶解度、半衰期、抗原性及其他生物活性。由于糖蛋白研究的復(fù)雜性，對(duì)海洋動(dòng)物中糖蛋白的研究相對(duì)較少，近年來(lái)才陸續(xù)開(kāi)展起這方面的研究工作，多集中在粗提物的生理、藥理活性研究方面，對(duì)均一的糖蛋白的結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系方面的研究報(bào)道則較少。

4、糖蛋白抗腫瘤現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四生物活性肽是介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，它小至由兩個(gè)氨基酸組成，大至由數(shù)百個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成，具有十分重要的生物學(xué)意義。生物活性肽的生物學(xué)意義主要體現(xiàn)：吸收機(jī)制優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸（指小肽）具有氨基酸不可比擬的生理功能兩類海洋生物多肽：天然存在與酶解得到的多肽（二）海洋生物活性肽現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四天然存在的海洋生物活性肽的種類：海綿多肽、海鞘多肽、?？嚯摹⒂舐荻嚯?、海藻多肽、魚(yú)類多肽、貝類多肽、海星多肽、海兔多肽等由于海洋的特殊環(huán)境，組成海洋多肽化合物的氨基酸除常見(jiàn)的氨基酸外，還有β-氨基異丁酸等多種海洋天然產(chǎn)物特有的氨基酸類型，具有多種生理活性1天然存在的活性肽現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.1海鞘多肽海鞘(Ascidian)屬于脊索動(dòng)物門(mén),海鞘綱與尾索動(dòng)物亞門(mén)的另外兩個(gè)綱稱為被囊動(dòng)物(Tunicate),約有2000種,海鞘是被囊動(dòng)物中種類最豐富、含有重要生物活性物質(zhì)最多的一類。現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四海鞘多肽是存在于海鞘中的環(huán)肽，

1980年，從海鞘Lissoclinumpatella中首次發(fā)現(xiàn)的環(huán)肽ulithiacyclamide。脂溶性、抗癌活性對(duì)L1210鼠性白血病細(xì)胞，ID50為0.35μg/ml。

對(duì)L1210鼠性白血病細(xì)胞，ID50為0.35μg/ml，對(duì)人的ALL細(xì)胞線CEM，ID50為0.01μg/ml。

現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1981年Rinehart等從加勒比海和加利福尼亞海域的群體海鞘Tridiemmumsulidum分離到3種海鞘素didemnineA，B，C：它們對(duì)RNA病毒和DNA病毒的增殖有抑制作用，對(duì)白血病細(xì)胞和B16黑色素瘤細(xì)胞有毒性作用。其中didemnineB的抗癌作用最強(qiáng)，只需0.0011μg/ml的濃度就能抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，是很有發(fā)展前途的抗癌物質(zhì)。B環(huán)七肽去氫膜海鞘素現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.2海兔多肽海兔屬于海洋腹足類軟體動(dòng)物。對(duì)海兔抗腫瘤括性肽的研究最早由Pettit小組以小鼠白血?。馨土瞿Ｐ蚉388為篩選體系，對(duì)耳狀截尾海兔（dolabellaauricularia）進(jìn)行系統(tǒng)的抗癌活性成分追蹤分離，已分離到dolastatin1～18，多為環(huán)膚類，具有強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。其中dolastatin3(2-9)對(duì)P388腫瘤細(xì)胞的ED50為2.7×l0-71μg·mL-1。機(jī)理：抑制微管聚合，促進(jìn)其解聚，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，對(duì)許多癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，是一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑(cytostasis)。環(huán)[脯-亮-纈-谷酰胺）Thz-(甘)Thz]現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四化合物55,56是從海兔分離到的直鏈肽，對(duì)P388白血病細(xì)胞IC50:0.04ng/ml.現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四化合物61是從海洋軟體動(dòng)物分離到的環(huán)肽kahalalideF

，對(duì)結(jié)核桿菌有極高的抑制活性。海洋環(huán)肽具有強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤活性,這些環(huán)肽主要來(lái)源于海鞘和海兔

現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.3海葵多肽文獻(xiàn)報(bào)道從海洋生物?？刑崛〉玫降娜芗?xì)胞性活性肽有：(1)存在于16種海葵中的鞘磷脂抑制性堿性多肽,平均相對(duì)分子質(zhì)量在15，000～21，000之間。(2)從Metridrumsenile屬?？蟹蛛x得到的具膽固醇抑制活性肽,其平均相對(duì)分子質(zhì)量在80，000左右?，F(xiàn)在是32頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.4海綿多肽海綿多肽是存在于離海綿目、外射海綿目、石海綿目、軟海綿目以及硬海綿目等海綿中的環(huán)肽化合物，目前已分離得到近40種。discoderminsA～D是從日本伊豆諸島海域采集的海綿中獲得，A可抑制枯草桿菌和奇異變形桿菌，具有抗炎作用。A～D均能抑制海星胚胎發(fā)育，且是磷酯酶A2的有效抑制劑，IC50為350～700nmol·L-1。現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.5芋螺多肽芋螺(Conus)是海洋腹足綱軟體動(dòng)物,其在獵取魚(yú)、海洋蠕蟲(chóng)、軟體動(dòng)物時(shí)常分泌一系列毒性物質(zhì),稱為芋螺毒素(Conotoxin)即芋螺多肽。目前已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素有近百種，大多為由10～30個(gè)氨基酸殘基組成的小肽，富含兩對(duì)或三對(duì)二硫鍵，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小核酸編碼的動(dòng)物神經(jīng)毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽。主要有α-芋螺毒素、μ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素及δ-芋螺毒素等。其活性與蛇毒、蝎毒等動(dòng)物神經(jīng)毒素相似,可引起動(dòng)物出現(xiàn)驚厥、顫抖及麻痹等癥狀花冠芋螺織錦芋螺番紅花芋螺將軍芋螺現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.8生物防御素生物防御素(Defensin)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組新型抗菌活性肽。它們通常都是由35～50個(gè)氨基酸殘基組成,且分子內(nèi)富含二硫鍵。由于其具有牢固的分子骨架、廣泛的分布以及生物活性功能,因而對(duì)它們的研究已成為當(dāng)前國(guó)際學(xué)術(shù)界中一個(gè)引人關(guān)注的研究熱點(diǎn)。現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四海藻多肽已從綠藻、藍(lán)藻等中分離得到。據(jù)報(bào)道，利用綠藻水提物制得一種內(nèi)含活性多肽成分。從培養(yǎng)的藍(lán)藻中也分離出一種具有魚(yú)毒性、抗菌、殺細(xì)胞活性的生物活性肽,已具備大規(guī)模生產(chǎn)能力。另外，還從海藻Pyymnesiumpatelliferum屬中提取出一種毒素肽Hormothamin，從藍(lán)-綠海藻屬Lyngbyamajuscula中分離得到具有細(xì)胞毒活性的環(huán)肽MajusculamideC現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2水產(chǎn)食品中天然存在的活性肽

存在于魚(yú)貝類組織中的天然肽類只有:三肽的谷胱甘肽；是一種特殊的Aa衍生物，又是含有巰基的三肽；鵝肌肽、鯨肌肽：屬咪唑化合物，統(tǒng)稱為咪唑二肽，是肉品風(fēng)味的前體物質(zhì)。

這些咪唑化合物一般在游泳能力強(qiáng)的魚(yú)類及鯨類肌肉中含量較多，因?yàn)檫溥颦h(huán)的pK值在生理pH附近，被認(rèn)為是具有緩沖作用的物質(zhì)?，F(xiàn)在是37頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

天然存在的活性肽大部分或含量微少,或提取難,不足以大量生產(chǎn)供給所需;化學(xué)人工合成又費(fèi)時(shí)費(fèi)力,成本昂貴;因此,人們更多地把目光投向開(kāi)發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物這條途徑上來(lái)。3

通過(guò)酶解得到的活性肽水解營(yíng)養(yǎng)蛋白生產(chǎn)生物活性肽的理論依據(jù):

在貯藏、營(yíng)養(yǎng)蛋白的多肽鏈內(nèi)部可能普遍存在著功能區(qū),選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆?這些多肽有可能被釋放出來(lái),從而制備各種各樣的生物活性肽。目前，應(yīng)用于酶解海洋動(dòng)物蛋白的酶主要還是陸源蛋白酶，包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、熱菌蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、膠原蛋白酶、木瓜蛋白酶等現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

從生物進(jìn)化上看,營(yíng)養(yǎng)和貯藏蛋白應(yīng)該是從功能蛋白進(jìn)化而來(lái)的,因?yàn)樵嫉纳锸遣豢赡芎铣纱罅看祟惖鞍椎?。?dāng)生物進(jìn)化到需要為后代發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)時(shí),它不可能憑空制造出一種營(yíng)養(yǎng)蛋白,最好的方法就是通過(guò)若干功能區(qū)(結(jié)構(gòu)域,DomainDNA）“組裝”出營(yíng)養(yǎng)或貯藏蛋白基因。所以,在不同的營(yíng)養(yǎng)和貯藏蛋白的多肽中可能廣泛存在著不同的功能區(qū),選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌妇涂蓪⑵溽尫懦鰜?lái),還原其功能特性,通過(guò)這種方法可以獲得相當(dāng)廣泛的生物活性短肽。現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四從免疫學(xué)看,盡管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白質(zhì),但是由于其非功能區(qū)存在著較大氨基酸差異,所以不能互相使用,因?yàn)樯镎峭ㄟ^(guò)免疫系統(tǒng)識(shí)別自身蛋白和外來(lái)蛋白的這些非功能區(qū)的差異來(lái)清除異己和保持自身穩(wěn)定性的。如果我們把注意力放在這些具有不同生理功能的生物活性短肽上,則我們可能有效地避免免疫排斥反應(yīng)的困擾。現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四例如,乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于注射可能會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),但如果用其水解所得到的短肽,就可能安全地用于注射。又如,實(shí)驗(yàn)證明免疫活性肽和白細(xì)胞介素相似,可以激活T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力,雖然它來(lái)源于動(dòng)物蛋白,但研究表明它可能安全地用于醫(yī)藥。現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

4海洋生物活性肽生理活性

易消化吸收（比氨基酸更易吸收）、保護(hù)胃粘膜及抗?jié)冏饔谩⒖咕?、抗氧化、抗過(guò)敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制AIDS病毒、促進(jìn)傷口愈合、增強(qiáng)骨強(qiáng)度和預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù)和促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)等現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

4.1降壓活性

原現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四活性評(píng)價(jià)方法活性評(píng)價(jià)方法：體外實(shí)驗(yàn)法和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法。體外實(shí)驗(yàn)法：1971年Cushman建立了體外紫外光度法——在37℃、pH8.3即模仿體內(nèi)環(huán)境的條件下,ACE降解血管緊張素I的模擬物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)產(chǎn)生馬尿酸，當(dāng)加入降血壓肽抑制ACE的降解作用后，馬尿酸的生成量減小，通過(guò)在紫外228nm處測(cè)量馬尿酸的光吸收值得到馬尿酸的生成量，從而評(píng)價(jià)降血壓肽的抑制效果?，F(xiàn)在是44頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

從海洋低值魚(yú)蝦中分離出具有抗高血壓活性的活性肽。其氨基酸序列如下:C8肽(沙丁魚(yú)):Leu-Lys-Val-Gly-Val-Lys-Gln-TyrC11肽(沙丁魚(yú)):Tyr-Lys-Ser-Phe-Ile-Lys-Gly-Tyr-Pro-Val-MetC8肽(金槍魚(yú)):Pro-Thr-His-Ile-Lys-Trp-Gly-AspC3肽(南極磷蝦):Leu-Lys-Tyr提高抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE的活性而具有降壓功能。水解Pr條件溫和，食用安全性極高，突出優(yōu)點(diǎn)是對(duì)血壓正常的人無(wú)降壓作用。現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

從鱈魚(yú)排中分離得到的分子量分別為30K,10K,5K和3K的四種活性寡聚肽，具有ACE抑制活性，且ACE抑制活性隨相對(duì)分子量降低而顯著增加，分子質(zhì)量為3K

的多肽具有最強(qiáng)的ACE抑制活性。此肽具有很好的水溶性，且無(wú)苦味，因此,更易投入實(shí)際應(yīng)用。相對(duì)分子質(zhì)量為5K的多肽具有顯著的抗氧化活性,其抗氧化活性與α-生育酚相當(dāng)?，F(xiàn)在是46頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四貽貝蛋白酶解降血壓肽的降壓活性及相對(duì)分子質(zhì)量與氨基酸組成

1實(shí)驗(yàn)方法1.1選取復(fù)合蛋白酶P1，在不同酶解條件下對(duì)貽貝蛋白進(jìn)行水解，采取UniformDesign(均勻設(shè)計(jì))方案，研究不同酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH等因素對(duì)ACE的抑制效果，并選擇最佳的酶解條件。1.2酶解液經(jīng)純化、加入活性修飾劑MAl，提取，冷凍干燥，制備降血壓肽，進(jìn)行活性檢測(cè)。文獻(xiàn)閱讀現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.3酶解樣品ACE抑制效果評(píng)價(jià)用紫外分光光度法分析不同酶解條件下制備的酶解降血壓肽的ACE抑制活性。228nm下測(cè)定其吸光值。將各酶解液反應(yīng)值與空白樣品對(duì)照，分析所得酶解降壓肽的ACE抑制率P：

P=[A-A(control)]/A×100％現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.4高效液相色譜法測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量--標(biāo)準(zhǔn)曲線法色譜條件：Waters600高效液相色譜儀；色譜柱：TSKgel2000；流動(dòng)相：V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)=45：55：0．1，檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm，體積流量：0．5mL/min，柱溫：30℃。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素c(MW12500)，抑肽酶(MW6500)，桿菌酶(MW1450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)。取酶解降血壓肽溶解，定容，取上清液濾紙過(guò)濾，再用0．22um微孔濾膜過(guò)濾，以供進(jìn)樣?，F(xiàn)在是50頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.5降血壓肽氨基酸組成分析水解氨基酸檢測(cè)：取樣品，加6mol/L鹽酸水解，110℃，24h，然后用0．3mm膜微孔過(guò)濾，定容，進(jìn)樣氨基酸自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。游離氨基酸檢測(cè)：取樣品，加水溶解，超聲波振蕩混勻，加適量鹽酸調(diào)酸，0.3mm膜微孔過(guò)濾，定容，進(jìn)樣氨基酸自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。1.6降血壓肽的動(dòng)物試驗(yàn)將樣品以3.0g·kg-1體重的劑量進(jìn)行灌喂。灌喂前和灌喂之后第2、4、6、8、10小時(shí)分別檢測(cè)收縮壓1次，記錄各血壓值?，F(xiàn)在是51頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2結(jié)果及討論2.1酶解條件對(duì)降血壓肽ACE抑制率的影響

回歸分析得回歸方程：1+15.299X2+11.971X3-4.310X22+0.194X1X2-0.141X3X4由此最佳的ACE抑制活性為90.23％，但試驗(yàn)結(jié)果ACE抑制率為86．55％。現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.2降血壓肽的相對(duì)分子質(zhì)量組成檢測(cè)結(jié)果

降血壓肽樣品相對(duì)分子質(zhì)量范圍在1.6ku以內(nèi)，從1～1.6ku，即lO～15、16肽的范圍，其含量為49.66％，0.6～1ku，即5～10肽范圍，樣品含量為15.73％，0.2～0.6ku范圍內(nèi)為7．96％，主要為2肽～4肽的小肽。目前比較公認(rèn)的是酶解降血壓肽的分子量相對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)較小，一般在幾個(gè)ku以內(nèi)。現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.3降血壓肽的氨基酸組成檢測(cè)結(jié)果分析氨基酸組成與酶解質(zhì)量和降血壓活性之間的關(guān)系

樣品含有較高比例的必需氨基酸

8.57水解氨基酸總量為59.6游離氨基酸總量為8.8谷氨酸被認(rèn)為能促進(jìn)腦細(xì)胞進(jìn)行呼吸，利于腦組織中氨的排除，調(diào)節(jié)人體的新陳代謝，而這將會(huì)對(duì)血壓造成一定的影響現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.4降血壓肽的降壓效果

處理4h和6h血壓變化的F值>0.05(2，9)，說(shuō)明服用降血壓肽4h和6h效果有顯著差異；降血壓肽在2~6h之內(nèi)的降壓效果具有顯著性(P=0．05)，血壓平均降低幅度為18～28mmHg。在6h處降壓效果達(dá)到最大值為28mmHg，且效果極為顯著(P=0．01)?，F(xiàn)在是55頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四抗腫瘤活性

現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

抗菌性

水生動(dòng)物抗菌肽的研究主要集中于甲殼綱動(dòng)物:1988年，從中國(guó)鱟血細(xì)胞用酸提取法得到一種含17個(gè)氨基酸的抗菌肽——鱟素，能與細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖成分結(jié)合形成復(fù)合物，在很低濃度下就能抑制G-及G+細(xì)菌的生長(zhǎng)。鱟素在低pH、高溫下相當(dāng)穩(wěn)定，是一種有應(yīng)用前景的抗菌活性物質(zhì)。1995年，從鱟體中分離得到一個(gè)79肽,與兔和牛的嗜中性白血球防御素相似;Noga等認(rèn)為美洲藍(lán)蟹的血細(xì)胞具有抗菌活性;Schnapp等從青緣蟹的血細(xì)胞中分離得到3種具有殺菌作用的肽,它們能夠選擇性地作用于細(xì)菌外層細(xì)胞膜的某些組分,如帶陰離子的磷脂,增大其滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng);現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四Chisholm等研究包括龍蝦和對(duì)蝦在內(nèi)的8種甲殼動(dòng)物的血細(xì)胞溶泡上清液對(duì)數(shù)種細(xì)菌的殺菌作用,證明其含有能殺滅細(xì)菌的因子;Song等發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦受感染后會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生類似殺菌肽類的物質(zhì)；Destoumieux等從養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦的血細(xì)胞和血漿中分離出幾種抗菌活性因子,其中3種具有抗真菌和抗細(xì)菌尤其是抗革蘭陽(yáng)性菌的活性?，F(xiàn)在是58頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四Azumi等從一種海鞘Halocyamineroretzi的血細(xì)胞中分離得到的抗菌肽HalocyamineA不僅在體外可抑制某些魚(yú)RNA病毒的生長(zhǎng),也能抑制某些海水細(xì)菌的生長(zhǎng)。Fernandes等從虹鱒魚(yú)皮中分離得到一種具有抗菌作用的核蛋白肽,在抵御胞內(nèi)或胞外病毒方面起著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)在是59頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四最近的研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)類中也存在大量的抗菌肽

Oren等從豹鰨中分離得到一種33肽的抗菌肽,具有比蜂毒素更強(qiáng)的抗菌活性,其作用可與其他天然的抗菌肽如蛙皮素、殺菌肽等相比;電鏡觀察顯示其抑菌機(jī)理是溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁。

Conlon等從海七鰓鰻的皮膚上分離得到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽,其氨基酸序列與老鼠的抗菌肽corticostatinR4和兔的抗菌肽corticosta2tinR1結(jié)構(gòu)相似。現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四從軟體動(dòng)物貝類的血液中提取到2種富含陽(yáng)離子與胱氨酸的抗菌小肽,其中1種含有34個(gè)氨基酸殘基,命名為Mytilin,結(jié)構(gòu)如下:Gly-Cys-Ala-Ser–Arg-Cys-Lys-Ala-Lys-Cys-Ala-Gly-Arg-Arg-Cys-Lys-Gly-Try-Ala-Ser-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-Arg-Cys-Tyr-Cys-Lys-Cys-Phe-Arg-Cys;

另一種含35～43個(gè)氨基酸殘基,屬于昆蟲(chóng)防御家族肽,與上述的Mytilin的結(jié)構(gòu)相似,它富含8個(gè)胱氨酸，具有廣譜抗細(xì)菌、抗真菌活性?，F(xiàn)在是61頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四牡蠣軟體中抗菌蛋白的制備及活性研究材料：長(zhǎng)牡蠣、大連灣牡蠣和近江牡蠣的肉菌株溶壁微球菌、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、金黃色葡萄球菌[JP-04-08、ATCC25922]、表皮葡萄球菌BP-04-18、大腸埃希氏菌[PC-04-21、ATCC25923]、銅綠假單胞菌[LN-04-12、ATCC27853]、變形桿菌BX-04-10、肺炎克雷伯桿菌、腸球菌、不動(dòng)菌屬。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25922、大腸埃希氏菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853。文獻(xiàn)閱讀美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所中國(guó)生物制品檢定所現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

方法1.抗菌蛋白的制備1.1粗蛋白的制備：取鮮活牡蠣5~10kg,以純水沖洗后取牡蠣軟體,洗凈瀝干約500g，經(jīng)粉碎、低溫研磨過(guò)100目篩,按重量比(w/w)1∶1加入注射用水,在1~4℃攪拌提取6~8h,勻漿液離心(4000r/min,40min),得蛋白粗提上清液。1.2液體濃縮蛋白的制備：將獲得的粗提液采用SMB220生物型錯(cuò)流超濾系統(tǒng)分級(jí)(膜截留分子量為50kDa),再以截留分子量為10kDa的膜濃縮5倍。濃縮液密閉存放或制備成凍干粉。現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.3蛋白的分離純化：取超濾濃縮液2.0ml,上樣于pH3.8檸檬酸-Na2HPO4緩沖液充分平衡后的CM-SepharoseFF層析柱(2.5cm×10cm)進(jìn)行層析,用200ml含0-1.0mol/LNaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫,收集活性峰,脫鹽濃縮后，上樣到以pH6.5NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液充分平衡的SephadexG-100層析柱(1.6cm×60cm)進(jìn)行層析,用平衡液進(jìn)行洗脫,收集活性峰,脫鹽濃縮后－20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨霞兓僮骶?℃進(jìn)行?，F(xiàn)在是64頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2抗菌蛋白性質(zhì)分析2.1純度和分子量測(cè)定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定：蛋白濃縮液(10μl,15μl)直接上樣進(jìn)行SDS分析,分離膠濃度為15％,電泳條件:電壓200V,56min,用0.5％考馬斯亮藍(lán)R250染色,使用不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)抗菌蛋白進(jìn)行分子量及其分布測(cè)試及分析。采用SDS方法測(cè)定：純化蛋白測(cè)定，分離膠濃度為12%,用0.5%考馬斯亮藍(lán)R250染色。2.2含氮量測(cè)定取3批次(200305021、20030808、20040411)牡蠣海洋溶菌酶凍干粉按照中華人民共和國(guó)藥典(2000年版二部)附錄ⅦD氮測(cè)定法測(cè)定。現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四3體外實(shí)驗(yàn)

3.1最低抑菌濃度（MIC)測(cè)定 采用平皿二倍稀釋法和Denlay多點(diǎn)接種器進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯及腦心浸液增菌;抗菌蛋白海洋低溫溶菌酶用水解酪蛋白瓊脂(MH)肉湯二倍稀釋成各種所需濃度,分別加適量至平皿中，MH培養(yǎng)基熔化后定量注入含藥液平皿內(nèi)混勻：生孢梭菌最終濃度為15×106cfu/ml,白色念珠菌18×106cfu/ml,其他菌液為1×105cfu/ml,需氧菌37℃培養(yǎng)18h,真菌20~25℃培養(yǎng)48h,厭氧菌置厭氧孵箱30~35℃孵育48h后觀察結(jié)果,無(wú)菌生長(zhǎng)的平皿中所含藥物最小的濃度即為MIC。

3.2最低殺菌濃度MB測(cè)定 采用試管二倍稀釋法,先測(cè)出試驗(yàn)菌的MIC,再依次將未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)各管培養(yǎng)液分別吸取0.1ml,轉(zhuǎn)移到不含藥液的瓊脂平皿中,培養(yǎng)條件同MIC測(cè)定,觀察測(cè)定結(jié)果,平皿上菌落數(shù)<5個(gè)的最小藥物濃度即為MBC。現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四4透射電鏡觀察抗菌蛋白對(duì)大腸埃希氏菌超微結(jié)構(gòu)的變化試驗(yàn)以正常大腸埃希氏菌培養(yǎng)12h制備透射電鏡樣品作陰性對(duì)照組。以LB液體培養(yǎng)基將抗菌蛋白稀釋成1.25mg/ml,加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸埃希氏菌,使?jié)舛葹?×105cfu/ml。搖床中培養(yǎng)(37min,200r/min)12h,離心棄上清,沉淀用磷酸緩沖液洗滌3次,制備透射電鏡樣品。固定、脫水、切片和染色后,作為實(shí)驗(yàn)組。透射電鏡下觀察大腸埃希氏菌超微結(jié)構(gòu)的變化?，F(xiàn)在是67頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

結(jié)果1抗菌蛋白的分離純化抗菌蛋白經(jīng)CM-SepharoseFF陽(yáng)離子交換層析分離后,鹽洗脫峰為活性峰,洗脫曲線見(jiàn)圖1,收集活性峰濃縮后上樣于SephadexG-100凝膠層析柱,洗脫曲線見(jiàn)圖2,第二個(gè)峰為活性峰,收集活性峰透析濃縮后作為純化樣品使用。現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2抗菌蛋白性質(zhì)分析2.1抗菌蛋白純度和分子量測(cè)定由圖a可見(jiàn),牡蠣－海洋溶菌酶為含多種蛋白的混合物,其分子量分布較寬,從10KD一直到100kDa都有分布,其中分子量分布在15kDa和23kDa左右的組分含量較多。三批牡蠣－海洋溶菌酶濃縮液均為多種蛋白的混合物,其電泳條帶相同,各條帶的分布及濃度基本相同,說(shuō)明樣品制備的重現(xiàn)性良好,工藝穩(wěn)定,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,見(jiàn)圖b。

純化樣品為單一條帶,由標(biāo)準(zhǔn)蛋白可知分子量約為39kDa?，F(xiàn)在是69頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.2含氮量測(cè)定

3批次抗菌蛋白凍干粉蛋白含量見(jiàn)表。現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.3抗菌蛋白對(duì)生孢梭菌、白色念珠菌的抗菌作用抗菌蛋白對(duì)生孢梭菌最低抑菌濃度為0.0156%,最低殺菌濃度為0.0313%;對(duì)白色念珠菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度均為0.0625%現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.4抗菌蛋白對(duì)臨床常見(jiàn)致病菌和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的抗菌活性現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四表明抗菌蛋白對(duì)臨床常見(jiàn)的致病菌具有良好的抗菌作用且呈劑量依賴性對(duì)3株標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株也有較好的抗菌作用現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2.5抗菌蛋白對(duì)大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的作用研究結(jié)果對(duì)照組:正常大腸桿菌形態(tài)為直桿狀,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整光滑,結(jié)構(gòu)緊密,細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁,細(xì)胞質(zhì)均勻?？咕鞍?1.25mg/ml)組,大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生改變,隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化越來(lái)越明顯:作用1h后,細(xì)胞壁松弛出現(xiàn)皺褶,菌體變短變粗,呈橢圓形,細(xì)胞質(zhì)固縮;2h后,大部分菌體呈圓球形;3h后,菌體呈不規(guī)則形,細(xì)胞壁缺失,細(xì)胞質(zhì)解體出現(xiàn)空腔,菌體裂解?，F(xiàn)在是74頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四

抗氧化性

Iwamoto等研究了鯖魚(yú)肽對(duì)低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用。結(jié)果表明,鯖魚(yú)肽能夠顯著延長(zhǎng)氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)期。對(duì)16名平均年齡為19歲的女性志愿者進(jìn)行了體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)。對(duì)照期內(nèi)食用含酪蛋白的食物,實(shí)驗(yàn)期內(nèi)食用含鯖魚(yú)肽的食物,劑量按16.9g蛋白/d,共10d。其他膳食組分同。提取靜脈血試樣測(cè)定LDL的氧化情況，結(jié)果表明,試驗(yàn)組第10d時(shí)靜脈血試樣LDL氧化的誘導(dǎo)期(66.2min)比0d時(shí)靜脈血試樣LDL氧化的誘導(dǎo)期(57.9min)長(zhǎng),而對(duì)照組在0d和10d的靜脈血試樣LDL氧化的誘導(dǎo)期之間不存在差異。現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四KimSe-Kwon等報(bào)道,黃鰭舌鰨魚(yú)皮膠原酶解得到的多肽也具有較好的抗氧化活性。采用現(xiàn)代生物工程技術(shù),從櫛孔扇貝中提取的海洋多肽,相對(duì)分子質(zhì)量為800～1000,經(jīng)藥理試驗(yàn)表明,具有抗氧化損傷作用,能清除超氧負(fù)離子和羥自由基,延緩皮膚老化,可顯著增強(qiáng)免疫細(xì)胞的代謝和增殖,是一種有潛力的抗氧化劑和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)劑。現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四發(fā)酵法制備魚(yú)鰾多肽及其抗氧化活性研究文獻(xiàn)閱讀1.材料與方法1.1材料、試劑與儀器鳙魚(yú)魚(yú)鰾水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；其他試劑均為分析純。SorvallEvolutionRC728411型冷凍離心機(jī)美國(guó)熱電公司；超濾設(shè)備及超濾膜美國(guó)Millipower公司；Lambada25型可見(jiàn)紫外檢測(cè)儀美國(guó)PE公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)。1.2菌種及培養(yǎng)基米曲霉(Aspergillusoryzae)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC40186)種子培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯汁1000ml，葡萄糖20g，自然pH值。現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.3方法1.3.1魚(yú)鰾預(yù)處理魚(yú)鰾用離子水浸泡漂洗，按每100g魚(yú)鰾加100ml去離子水進(jìn)行均漿，勻漿液稀釋到蛋白濃度5%(m/V)后進(jìn)行巴氏滅菌(60℃，30min)，備用。1.3.2發(fā)酵菌種的制備從活化的菌種保藏斜面中挑取兩環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，28℃、120r/min培養(yǎng)36h，使菌體濃度達(dá)到106CFU/ml。1.3.3魚(yú)鰾勻漿液發(fā)酵按5%(V/V)將發(fā)酵菌株液接種于魚(yú)鰾勻漿液28℃、120r/min培養(yǎng)，于不同發(fā)酵時(shí)間取樣。發(fā)酵液于4℃10000r/min離心30min，上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液為魚(yú)鰾多肽混合液，冷凍干燥，得魚(yú)鰾多肽粗粉，冷凍保藏備用?，F(xiàn)在是78頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四1.3.4超濾分離用去離子水將發(fā)酵液配成10mg/ml的樣液，分別通過(guò)截留分子量為10、3、1kD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集不同截留分子量的濾液，分別編號(hào)為肽Ⅰ(Mw≤1kD)、肽Ⅱ(1kD≤Mw≤3kD)、肽Ⅲ(3kD≤Mw≤10kD)1.3.5測(cè)定方法多肽含量的測(cè)定采用以酸可溶性多肽計(jì)，將等體積的0.4mol/L三氯乙酸(TCA)加入到多肽混合液中，靜置0.5h后10000r/min離心10min，去除酸不溶性的蛋白和長(zhǎng)鏈肽沉淀，用雙縮脲法測(cè)定上清液中的多肽含量；測(cè)定發(fā)酵液水解度和平均肽鏈長(zhǎng)度。清除O2-·能力測(cè)定采用NBT法；清除·OH能力測(cè)定采用D-2-脫氧核糖法；抗氧化力測(cè)定采用亞油酸自氧化法?，F(xiàn)在是79頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵過(guò)程中魚(yú)鰾蛋白水解動(dòng)態(tài)現(xiàn)在是80頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四配制多肽液濃度為10mg/ml，測(cè)定自由基清除能力和抗氧化能力。2.2魚(yú)鰾發(fā)酵液的抗氧化活性發(fā)酵時(shí)間40h，水解度為22%時(shí)，所得魚(yú)鰾肽的抗氧化力最強(qiáng)?，F(xiàn)在是81頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四魚(yú)鰾多肽液經(jīng)不同截留分子量的超濾膜超濾后，各片段濾液配成質(zhì)量濃度為10mg/ml的多肽液，分別測(cè)定其自由基清除能力和抗氧化能力。2.2超濾液的抗氧化活性由5～12個(gè)氨基酸殘基組成片段具有較強(qiáng)抗氧化性現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四利用微生物在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)的蛋白酶水解魚(yú)鰾蛋白：魚(yú)鰾營(yíng)養(yǎng)成分全面豐富，良好的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；高含量的魚(yú)鰾蛋白可被微生物酶水解，通過(guò)控制發(fā)酵時(shí)間，便可制備出鏈長(zhǎng)適當(dāng)，具有一定生理活性的魚(yú)鰾多肽。顯而易見(jiàn)，其生產(chǎn)成本低廉，因而十分適于工業(yè)化生產(chǎn)。O2·和·OH等活性氧自由基誘導(dǎo)的氧化損傷一直被認(rèn)為是引起衰老、細(xì)胞損傷和癌變的原因之一，魚(yú)鰾肽富含供氫體，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應(yīng)。微生物發(fā)酵法尚存在一些不足，主要表現(xiàn)在發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，肽鏈長(zhǎng)度分布范圍較廣，后續(xù)分離純化的困難。3討論現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四深化研究的方向?qū)ξ⑸锇l(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，縮短發(fā)酵時(shí)間；控制好水解度(發(fā)酵程度)，建立不同發(fā)酵時(shí)間與分子量分布的關(guān)系；對(duì)魚(yú)鰾多肽的體內(nèi)抗氧化效果及其他的生理活性進(jìn)行研究；對(duì)制備所得魚(yú)鰾多肽中具有顯著生物活性的肽段序列進(jìn)行測(cè)序，揭示結(jié)構(gòu)和活性之間的構(gòu)效關(guān)系。現(xiàn)在是84頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四這類肽可作為腸道營(yíng)養(yǎng)劑或以流質(zhì)食物形式提供給處于特殊年齡或特殊身體狀況下的人(如消化能力不健全的新生兒,消化能力退化的老年人;經(jīng)過(guò)手術(shù)特別是消化道手術(shù)后的康復(fù)者或有待于治療的病人;由于過(guò)度疲勞、生活沒(méi)有規(guī)律而胃腸功能下降者;還有對(duì)蛋白質(zhì)抗原性過(guò)敏的過(guò)敏性體質(zhì)者等)。易消化功能肽不僅能提供豐富的必需氨基酸,還能促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖,促進(jìn)乳酸桿菌的生長(zhǎng)發(fā)育,有望在酸奶、面包、乳酪中提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,改善風(fēng)味和品質(zhì)。

易消化吸收

現(xiàn)在是85頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四幾個(gè)思考（1）將陸地酶工程技術(shù)應(yīng)用于海洋蛋白酶解活性肽的研究,在此基礎(chǔ)上,開(kāi)發(fā)海洋蛋白資源酶解專用工程用酶。將陸地微生物發(fā)酵工程和酶工程技術(shù)應(yīng)用于海洋蛋白資源的綜合利用研究,以海洋生物蛋白資源為原料,通過(guò)生物酶解、提取、加工,可生產(chǎn)許多酶解陸地蛋白源和化學(xué)合成所無(wú)法生產(chǎn)的產(chǎn)品和材料,研制出系列天然、高效、新穎的生物活性肽?，F(xiàn)在是86頁(yè)\一共有95頁(yè)\編輯于星期四（2）大力加強(qiáng)用于海洋蛋白源酶解的專用蛋白酶制劑的開(kāi)發(fā)由于陸地生態(tài)環(huán)境、淡水生態(tài)環(huán)境與海洋生態(tài)環(huán)境具有很大的差異,海洋生物為了適應(yīng)所處的特殊的生態(tài)環(huán)境,其氨基酸的組成和氨基酸的序列肯定與陸地及淡水生物的蛋白源具有很大的差別。目前進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶制劑可能無(wú)法高效用于海洋蛋白源的酶解。因此,應(yīng)從海洋生物體內(nèi)、海水及海洋污泥中分離、純化可高效酶解不同海洋蛋白