免疫印跡法的實驗技術(shù)

一、Western-Blot簡介WesternBlot，又稱為免疫印跡（Immunoblot）,是70年代末80年代初發(fā)展起來的蛋白質(zhì)測定技術(shù)。蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認為是美國斯坦福大學的喬治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼爾·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化學》（AnalyticalBiochemistry）中首次被稱為WesternBlot?，F(xiàn)在是1頁\一共有45頁\編輯于星期三印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。WesternBlot印跡方法，是檢測蛋白質(zhì)混合液體中某種特定目的蛋白的定性方法，也可作為確定同一種蛋白質(zhì)在不同細胞或者同一種細胞不同條件下的相對含量的半定量方法?，F(xiàn)在是2頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗主要內(nèi)容：實驗用途2實驗注意事項

4實驗方法及步驟33

實驗原理31現(xiàn)在是3頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗原理

將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠【SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS)】電泳使蛋白質(zhì)按分子量的大小進行分離

→凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相支持物（硝酸纖維素膜或PVDF膜）上→用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜上的靶蛋白進行特異性結(jié)合→與經(jīng)辣根過氧化物酶標記（偶聯(lián)）的二抗結(jié)合→用ECL發(fā)光或DAB顯色檢測。如果轉(zhuǎn)印膜上含有靶蛋白，經(jīng)DAB顯色后上出現(xiàn)棕黃色條帶蛋白條帶?，F(xiàn)在是4頁\一共有45頁\編輯于星期三WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。現(xiàn)在是5頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗用途用于檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在。對特異性蛋白質(zhì)進行半定量分析。現(xiàn)在是6頁\一共有45頁\編輯于星期三蛋白免疫印跡組成凝膠電泳1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶2把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上樣品的印跡3用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原免疫學檢測現(xiàn)在是7頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗步驟

提取細胞或組織蛋白→測定蛋白含量→制備SDS膠→蛋白變性、上樣→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗→TBST洗膜→HRP標記的二抗→TBST洗膜→ECL底物顯色→X光片曝光、顯色→結(jié)果分析現(xiàn)在是8頁\一共有45頁\編輯于星期三現(xiàn)在是9頁\一共有45頁\編輯于星期三

二、蛋白樣本的制備和濃度的測定蛋白的提?。阂话惆ńM織蛋白提取、細胞蛋白的提取組織蛋白提取組織和裂解液（加入蛋白酶抑制劑，為防止細胞內(nèi)蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解）按比例配制-置于玻璃勻漿器中，充分研磨（冰上操作）4℃離心，12000rpm，10min取上清分裝1.5ml離心管中－20℃保存。（低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解。）

蛋白酶抑制劑：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根據(jù)具體情況具體選擇?，F(xiàn)在是10頁\一共有45頁\編輯于星期三注意事項

注意個人防護。PMSF嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立即用大量水沖洗。所用離心機需提前預冷。為防止蛋白降解，所有操作應(yīng)在冰上完成。吸取蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來?，F(xiàn)在是11頁\一共有45頁\編輯于星期三蛋白濃度的測定原因：WesternBlot作為一項半定量實驗技術(shù)，電泳前，必須對不同的樣品進行總蛋白含量測定。蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定;蛋白質(zhì)含量太高則會使帶形扭曲,甚至會影響此電泳方法的分辨力?，F(xiàn)在是12頁\一共有45頁\編輯于星期三方法：目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍法Bradford法）。目前實驗室測蛋白濃度都用試劑盒，如BCA法試劑盒.現(xiàn)在是13頁\一共有45頁\編輯于星期三BCA法工作原理BCA(bicinchoninicacid二辛可酸)法測定蛋白質(zhì)的原理與Lowery法相似。即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中肽鍵結(jié)構(gòu)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA特異地與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍色復合物，在562nM處有最大光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可以根據(jù)吸收值測定蛋白質(zhì)濃度。該測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)去垢劑等影響小?，F(xiàn)在是14頁\一共有45頁\編輯于星期三SDS電泳SDS電泳法，即十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳法。原理1．在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的遷移率主要取決于分子大小和形狀以及所帶電荷多少。2．在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合（1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計?，F(xiàn)在是15頁\一共有45頁\編輯于星期三現(xiàn)在是16頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗前的準備設(shè)備和材料的準備:電泳槽的準備(本實驗用垂直電泳槽)、電泳儀的準備、離心機、電磁爐、煮鍋、移液槍、槍頭、燒杯、量筒試劑的準備和配置:雙蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH為8.8)、Tris-HCl(PH為6.8)、10%SDS、10%過硫酸銨(AP)、TEMED、電泳上樣緩沖液、電泳緩沖液、蛋白Marker現(xiàn)在是17頁\一共有45頁\編輯于星期三根據(jù)待測樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠和濃縮膠的濃度.（一般濃縮膠為5%，分離膠根據(jù)所測蛋白分子量定）凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212現(xiàn)在是18頁\一共有45頁\編輯于星期三作用濃縮膠：當樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負極，下方為正極)，在凝膠中形成移動界面并帶動凝膠中所含SDS負電荷的多肽復合物向正極推進。樣品首先通過高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS多肽復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）（0.5-1cm）。分離膠：由于膠孔徑小，而且成為一個整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達到彼此分開。(PH為8.8)現(xiàn)在是19頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗步驟

組裝SDS凝膠用玻璃槽↓配制和灌注分離膠↓用水壓線30-40分鐘直至分離膠凝固↓

倒掉壓線水配制和灌注濃縮膠↓插入樣品梳↓

凝膠直至濃縮膠凝固↓制備樣品樣品:上樣緩沖液=4:1,混勻1000C加熱5分鐘,離心取上清)

↓

拔出樣品梳↓加入電泳緩沖液,上樣，電泳↓電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止夾心式垂直電泳槽現(xiàn)在是20頁\一共有45頁\編輯于星期三蛋白變性的原因上樣蛋白為蛋白樣本和上樣緩沖液的混合物，按比例配制，100℃煮5min。其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時使整個蛋白帶上負電荷?，F(xiàn)在是21頁\一共有45頁\編輯于星期三注意事項玻璃板要清潔,對齊卡嚴，防止漏膠。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱量或配膠時應(yīng)戴手套及口罩.過硫酸銨會緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制.溶液中一旦加入TEMED，應(yīng)立即混勻并快速灌注入玻璃夾槽中.濃縮膠緩沖液(PH為6.8)、分離膠緩沖液(PH8.8)，PH值要準確。膠灌入前要充分混勻，灌膠要緩慢,避免有氣泡的產(chǎn)生.為保持電泳的平衡，在無樣品孔中也應(yīng)加入適量的電泳上樣緩沖液.正確連接電泳連線（負極在上，正極在下）以保證蛋白由上向下方向電泳?，F(xiàn)在是22頁\一共有45頁\編輯于星期三說明：不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的分子量是不可靠的。包括：電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35,000。因此，最好至少用兩種方法來測定未知樣品的分子量，互相驗證。有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果互相參照?，F(xiàn)在是23頁\一共有45頁\編輯于星期三四、轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)印跡法就是將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上。常用的固相支持物有NC（硝酸纖維素）膜、尼龍膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性，價格比NC膜要貴。NC膜更常用?，F(xiàn)在是24頁\一共有45頁\編輯于星期三附：膜的選擇主要根據(jù)：膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量）膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。┯袃煞N規(guī)格：0.45um和0.2um（forMW<20kDa)。不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適合用于所選顯色方法）現(xiàn)在是25頁\一共有45頁\編輯于星期三轉(zhuǎn)膜通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。電泳印跡效率更高。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成"三明治"形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開凝膠結(jié)合在膜上。轉(zhuǎn)移后的膜就稱為一個印（blot），用于對蛋白質(zhì)的進一步檢測?，F(xiàn)在是26頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗前的準備

設(shè)備和材料的準備:轉(zhuǎn)移電泳槽的準備(本實驗用垂直電泳槽)、轉(zhuǎn)移電泳儀的準備、膜、濾紙、海綿墊、玻璃棒試劑的準備和配置:電轉(zhuǎn)液、甲醇（PVDF膜）、（考馬斯亮藍染色液、麗春紅染色液）現(xiàn)在是27頁\一共有45頁\編輯于星期三根據(jù)待測樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇轉(zhuǎn)移的電流大小及時間.我們通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間，具體可以根據(jù)實際適當調(diào)整。目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度

轉(zhuǎn)移時間(h)

801408%

1.5-2.0

258010%

1.5

15—4012%

0.75

<2015%0.5現(xiàn)在是28頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗步驟NC膜預處理：（剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入1×轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5分鐘以上。注意：必須保證NC膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中，裁剪時要戴手套，避免手上蛋白將膜污染。）剪裁6層濾紙，比膠略大，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用，同時4層海綿墊也用轉(zhuǎn)移液浸泡。取膠：撬開玻璃板，將多余的膠切除，把裁好的膠放人轉(zhuǎn)移液中。轉(zhuǎn)膜①制作“三明治”：由夾子的黑板（陰極）側(cè)開始，依次為黑板→海綿墊片→3層濾紙→膠→NC膜→三層濾紙（注意：排除氣泡）→海綿墊片(陽極)，扣緊轉(zhuǎn)膜夾板，放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中（見蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移示意圖）。

現(xiàn)在是29頁\一共有45頁\編輯于星期三現(xiàn)在是30頁\一共有45頁\編輯于星期三②正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線，保證電荷由負極向正極流動。接通電源，恒壓狀態(tài)下轉(zhuǎn)膜（此步操作宜在4℃進行）。③小心取出轉(zhuǎn)移膜，做好標記，在1×TBST液中漂洗兩次。（用考馬斯亮藍快速染色液處理凝膠，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全,用麗春紅染色液膜,檢測蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)移到膜上.）現(xiàn)在是31頁\一共有45頁\編輯于星期三打開轉(zhuǎn)膜夾板，由陰極側(cè)海綿墊片→3層濾紙→樣品凝膠→NC膜→三層濾紙（排除氣泡）→海綿墊片陽極側(cè)現(xiàn)在是32頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗注意事項

PVDF膜需100%甲醇預處理，再用緩沖液平衡，才能用。必須保證NC膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中,濾紙要充分浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中.操作要輕，避免膠膜的破損。記住“黑面膠，白面膜”，夾子的黑面朝架子的黑面。必須保證“三明治”各層之間均無氣泡。電轉(zhuǎn)移時最好為恒流,電轉(zhuǎn)移的時間和電流大小取決于凝膠的厚度和蛋白質(zhì)分子量的大小.分子量大,電流稍大時間長;分子量大,電流小時間短;注意做好膜上的標記?，F(xiàn)在是33頁\一共有45頁\編輯于星期三五、固相免疫檢測轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用ECL（增強化學發(fā)光）發(fā)光或DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測目的蛋白?，F(xiàn)在是34頁\一共有45頁\編輯于星期三DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物，從而指示目的蛋白位置及強弱。ECL試劑采用氧化還原反應(yīng)的原理：利用二抗上標記的辣根過氧化物酶(HRP)，使底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而發(fā)出熒光。ECL發(fā)光相對于DAB顯色而言，具有發(fā)光持久，靈敏度高(一般可達到pg級以上)等優(yōu)點，且DAB具有致癌性?，F(xiàn)在是35頁\一共有45頁\編輯于星期三ECL結(jié)果DAB結(jié)果現(xiàn)在是36頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗前的準備

1.設(shè)備和材料的準備:洗膜用平皿搖床ECL發(fā)光所需(避光盒、X-光片、X-光片曝光盒等)2.試劑的準備和配置:封閉液(5%脫脂奶粉、BSA、WesternBlot膜封閉液）

一抗二抗抗體稀釋液TBST緩沖液ECL試劑盒或DAB試劑盒現(xiàn)在是37頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗步驟

1、封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜浸入封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動封閉1h（或4℃過夜）；（封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點，使抗體只能跟特異的蛋白結(jié)合）2.一抗反應(yīng)

①將一抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度；

②將封閉后的膜放入一抗工作液中，4℃反應(yīng)過夜(或37℃,2小時)。3.洗膜

將膜從一抗中取出，TBST洗滌10min×3，室溫下緩慢搖動洗滌。4.二抗反應(yīng)

①將二抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度。

②將膜放入二抗工作液中室溫30min。5.洗膜TBST洗滌10min×3，室溫下緩慢搖動洗滌6.曝光及洗片（或DAB顯色）現(xiàn)在是38頁\一共有45頁\編輯于星期三曝光及洗片方法①按1:1（v/v）混合ECL試劑盒中兩種液體。②將上述混合液均勻鋪在NC膜表面，室溫作用2分鐘。抖掉膜上液體，將其放入鋪有保鮮膜的曝光盒中，再將保鮮膜折疊，以包裹住NC膜（避免在膜的上面出現(xiàn)氣泡）。③在暗室中（紅光下）將X光膠片直接壓于包裹后的膜上，曝光盒中曝光適當時間。④將曝光后X光片放入顯影液中顯影、清水中漂洗、定影液中定影1分鐘（具體曝光時間及顯影時間需根據(jù)顯影結(jié)果作出調(diào)整）現(xiàn)在是39頁\一共有45頁\編輯于星期三實驗注意事項

1.處理膜的過程中，切勿使膜干掉（否則導致背景增高）2.選擇合適的一抗及二抗?jié)舛龋舛雀卟灰欢ㄐЧ?，過高會導致背景變黑）3.應(yīng)考慮ＥＣＬ試劑的發(fā)光強度及其淬滅時間來選擇合適的曝光時間。4.保鮮膜包裹NC膜時，避免膜上有氣泡，影響顯影。5、顯影、定影要充分，X平要完全浸沒在液面下?，F(xiàn)在是40頁\一共有45頁\編輯于星期三WesternBlot常見問題分析

SDS電泳

膠不平