多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)第1頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、PCR技術(shù)概念：是一種體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。應(yīng)用：第2頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA復(fù)制原理第3頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈;③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器.二、PCR技術(shù)的原理第4頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA雙鏈單鏈變性（加熱95℃

）復(fù)性（緩慢冷卻55℃

）4、DNA分子的熱變性原理：變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合第5頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、使用PCR的前提是：已知目的基因(或DNA片段)兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成反應(yīng)必需的雙引物。

PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。

第6頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四、PCR條件：

四種脫氧核苷酸;耐高溫的DNA聚合酶;兩種引物;模板；緩沖溶液嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。第7頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入解旋解旋酶加熱變性引物引物合成酶外源加入底物細(xì)胞內(nèi)源外源加入DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液第8頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’-OH端為3’

磷酸基團(tuán)的末端為5’

復(fù)制的方向：子鏈的5’

端向3’端延伸第9頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四溫泉中水生嗜熱桿菌第10頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

DNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌分離出來(lái)的DNA聚合酶。酶活性在1000C條件下，能保持幾個(gè)小時(shí)。而其最適溫度在720C左右。

第11頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第12頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

引物

引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵。*引物長(zhǎng)度以15～30個(gè)堿基為宜，引物過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響與模板的退火效率。*(G＋C)含量最好保持在約40%～60%，(G＋C)含量越高退火溫度越高，退火溫度過(guò)高過(guò)低都不利于PCR的反應(yīng)。*兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)。*引物濃度要適宜.用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)特異性也較好。第13頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

快速、高效、靈活、易于操作五、PCR技術(shù)的特點(diǎn)六、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液第14頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR不同點(diǎn)解旋（解旋酶；高溫解旋）引物（RNA；人工合成的DNA單鏈）DNA聚合酶（耐不耐高溫）反應(yīng)環(huán)境（細(xì)胞內(nèi)環(huán)境；緩沖溶液）第15頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四六、PCR的反應(yīng)過(guò)程1、PCR的反應(yīng)步驟

PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）

模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備.2、循環(huán)過(guò)程第16頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第17頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四②復(fù)性（退火）

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到550C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合第18頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第19頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四③延伸

DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈.第20頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第21頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列第22頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量第23頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四七、PCR循環(huán)的結(jié)果

②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增;

①?gòu)牡诙喲h(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸;第24頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四八、PCR的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次第25頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR儀第26頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四微量離心管微量移液器第27頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）、PCR的反應(yīng)過(guò)程每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸

從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。第28頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)--變性第29頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)--變性第30頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)--變性第31頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)—復(fù)性第32頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)—延伸第33頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)—延伸第34頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)—延伸第35頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR循環(huán)—延伸第36頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第37頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR整個(gè)過(guò)程第38頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

反應(yīng)程序

95℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；

95℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；

72℃

延伸7分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物在4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA含量或用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況。

第39頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次95°C，10min－－30次９5℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９5℃，1min55℃，30s72℃，1min第40頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四討論1：為何酶促反應(yīng)需要那么高的溫度為了確保模板是單鏈，尤其是第一次反應(yīng)的模板延伸的溫度必須大于退火溫度，而小于變性溫度DNA聚合酶不能熱變性，所以選用耐高溫的聚合酶第41頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四紫外分光光度計(jì)測(cè)定PCR產(chǎn)物含量將PCR產(chǎn)物10倍稀釋后，用蒸餾水做空白對(duì)照，在260nm處測(cè)定稀釋后PCR產(chǎn)物的吸光值（A260nm），根據(jù)下面的公式計(jì)算DNA含量。DNA的濃度(μg/ml)=A260nm0.02×稀釋倍數(shù)1μg/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02。第42頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

123M45

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1，2，4，5：PCR產(chǎn)物；3，陰性對(duì)照；M,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（從上向下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）第43頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。第44頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定第45頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A原理簡(jiǎn)單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作第46頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是A反復(fù)洗滌B不怕外源DNA污染C高壓滅菌D在—20℃儲(chǔ)存第47頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)小結(jié)

PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（）三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補(bǔ)Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72℃第48頁(yè)，共53頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按