免疫學(xué)診斷技術(shù)

免疫學(xué)診斷技術(shù)目錄醫(yī)療器械根底知識(shí)體外診斷試劑分類膠體金技術(shù)簡介酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介2020/11/32一醫(yī)療器械根底知識(shí)1、醫(yī)療器械監(jiān)視管理?xiàng)l例于1999年12月28日國務(wù)院第24次常務(wù)會(huì)議通過，2000年4月1日起施行。2、醫(yī)療器械：醫(yī)療器械是指單獨(dú)或者組適宜用于人體的儀器、設(shè)備、器具、材料或者其他物品，包括所需要的軟件；其用于人體體表及體內(nèi)的作用不是用藥理學(xué)、免疫學(xué)或者新陳代謝的搜段獲得，但是可能有這些手段參與并起一定的輔助作用；其使用旨在到達(dá)以下預(yù)期目的：〔1〕對疾病的預(yù)防、診斷、治療、監(jiān)護(hù)、緩解；〔2〕對損傷或者殘疾的診斷、治療、監(jiān)護(hù)、緩解、補(bǔ)償；〔3〕對解剖或者生理過程的研究、替代、調(diào)節(jié)；〔4〕妊娠控制。2020/11/331.1醫(yī)療器械分類醫(yī)療器械按照其醫(yī)療器械分類斷定的根據(jù)〔一〕醫(yī)療器械根據(jù)其構(gòu)造特征分為：有源器械和無源器械?！捕掣鶕?jù)不同的預(yù)期目的，可將醫(yī)療器械歸入一定的使用形式。無源器械的使用形式有：醫(yī)用敷料；外科器械；重復(fù)使用外科器械；一次性無菌器械；植入器械；護(hù)理器械、體外診斷試劑、其他無源接觸或無源輔助器械等。有源器械的使用形式有：診斷監(jiān)護(hù)器械；輸送體液器械；實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、醫(yī)療消毒設(shè)備；其他有源器械或有源輔助器械等。2020/11/34

〔三〕根據(jù)使用中對人體產(chǎn)生損傷的可能性、對醫(yī)療效果的影響，醫(yī)療器械使用狀況可分為接觸或進(jìn)入人體器械和非接觸人體器械。2020/11/35

根據(jù)醫(yī)療器械的危險(xiǎn)性：第一類是指，通過常規(guī)管理足以保證其平安性、有效性的醫(yī)療器械；第二類是指，對其平安性、有效性應(yīng)當(dāng)加以控制的醫(yī)療器械；第三類是指，用于支持、維持生命；對人體具有潛在危險(xiǎn)，對其平安性、有效性必須嚴(yán)格控制的醫(yī)療器械。2020/11/361.2醫(yī)療器械消費(fèi)企業(yè)應(yīng)當(dāng)符合以下條件：

具有與其消費(fèi)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員；具有與其消費(fèi)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的消費(fèi)場地及環(huán)境；具有與其消費(fèi)的醫(yī)療器械相適應(yīng)的消費(fèi)設(shè)備；具有對其消費(fèi)的醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)展質(zhì)量檢驗(yàn)的機(jī)構(gòu)或者人員及檢驗(yàn)設(shè)備。2020/11/371.3醫(yī)療器械經(jīng)營企業(yè)應(yīng)當(dāng)符合以下條件具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應(yīng)的經(jīng)營場地及環(huán)境；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械相適應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)人員；具有與其經(jīng)營的醫(yī)療器械產(chǎn)品相適應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)、維修等售后效勞才能。2020/11/38

二體外診斷試劑

2.1定義體外診斷〔IVD，InVitroDiagnosis〕試劑，包括可單獨(dú)使用或與儀器、器具、設(shè)備或系統(tǒng)組合使用，在疾病的預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察、安康狀態(tài)評價(jià)以及遺傳性疾病的預(yù)測過程中，在人體之外通過對人體的樣本〔如血液、體液、組織等〕進(jìn)展檢測而獲取臨床診斷信息的產(chǎn)品和效勞，包括儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等。原理是通過試劑和體內(nèi)物質(zhì)在體外的反響強(qiáng)度或速度來判斷體內(nèi)物質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量，通過和標(biāo)準(zhǔn)品的比較來判斷人體的生理狀態(tài)。2020/11/391.臨床生化試劑：用化學(xué)方法使樣本產(chǎn)生變化，通過測吸光度，波長及顏色反響等進(jìn)展疾病的診斷、治療和監(jiān)控；2.免疫診斷試劑：免疫生物學(xué)開展很快，利用抗原和抗體的特異性反響的原理進(jìn)展疾病的診斷；2.2體外診斷試劑的分類2020/11/3103.分子診斷試劑：應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)造或表達(dá)程度的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。4.功能檢測試劑：如血凝試劑，看凝血狀態(tài)是否正常。5.其他：細(xì)胞染色切片，鏡像等2020/11/3112.3免疫學(xué)診斷試劑的類型1.按方法分為間接免疫學(xué)試劑和直接免疫學(xué)試劑〔如雙抗體夾心法，雙抗原夾心法，間接法，競爭法等〕；2.按示蹤劑分為放射免疫法，酶聯(lián)免疫法，熒光法，化學(xué)發(fā)光法，膠體金法，乳膠法等；2020/11/312

免疫層析膠體金技術(shù)是出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式,該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相,通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析材料上泳動(dòng),并同時(shí)使樣品中經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記的待測物與包被在層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異、高親和性的免疫。三膠體金技術(shù)簡介2020/11/3131膠體金標(biāo)記技術(shù)的相關(guān)定義1.1定義免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金標(biāo)記膠體金標(biāo)記，本質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒外表的包被過程。吸附機(jī)理一般認(rèn)為是膠體金顆粒外表負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成結(jié)實(shí)結(jié)合。2020/11/314膠體金顆粒對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，而不被壞其生物活性，可以與蛋白質(zhì)等〔葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白〕等非共價(jià)結(jié)合，形成膠體金標(biāo)記物。2020/11/315

1.2透射電鏡下觀察金顆粒的形狀劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大2020/11/3162膠體金的制備量取200ml超純水，加熱至沸騰，并保持微沸。參加15ml1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸5分鐘。參加1%的氯金酸5ml,繼續(xù)煮沸，待顏色有變化后計(jì)時(shí)，煮沸10min。停頓攪拌，冷卻至室溫。2020/11/3172.1膠體金粒徑的大小與復(fù)原劑的量有關(guān)系粒子大小不同，光吸收性不同，顏色亦不同。1％檸檬酸三鈉ml0.300.450.701.001.502.00

金溶膠顏色藍(lán)灰紫灰紫紅紅橙紅橙

吸收峰(nm)220240535525522518

徑粒(nm)14797.571.54024.5152020/11/318

3.制備高質(zhì)量膠體金的本卷須知

〔1〕玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒?！?〕試劑配制必須保持嚴(yán)格的純潔，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜〔0.45μm〕過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)?！?〕配制膠體金溶液的pH以中性〔pH7.2〕較好?！?〕氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。2020/11/319

4膠體金技術(shù)的種類及特點(diǎn)4.1快速免疫金滲濾法主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體。2020/11/320斑點(diǎn)金免疫滲濾2020/11/321

4.2免疫層析法

以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體漸漸向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色〔紅色〕反響，檢測抗原/抗體。2020/11/322襯板樣品墊金標(biāo)墊吸收墊膜膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)成2020/11/323

雙抗體夾心法標(biāo)本Goldtestcontrol2020/11/324競爭法標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)抗原Goldtestcontrol2020/11/325

其檢測原理與上述的其它方法有所不同：膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體，而檢測線包被小分子抗原，質(zhì)控線包被抗鼠IgG。檢測時(shí)，樣本中的待檢抗原首先與金標(biāo)抗體結(jié)合，上行到達(dá)檢測帶時(shí)，如待檢抗原把一定量的抗體完全飽和，則金標(biāo)抗體將不能與檢測帶的抗原結(jié)合，不會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的紅色條帶，為陽性結(jié)果。如標(biāo)本中無待檢抗原，則金標(biāo)抗體與檢測帶的抗原結(jié)合，形成紅色條帶，為陰性結(jié)果。選用該方法應(yīng)特別注意膠體金顆粒的抗體吸附量及包被抗原量。2020/11/326間接法2020/11/327測定時(shí)將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即汲取液體向上端挪動(dòng)，流經(jīng)C處時(shí)使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動(dòng)其向膜條滲移。雙抗體夾心法為例2020/11/328假設(shè)標(biāo)本中有待測特異抗原，即可與免疫金復(fù)合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯出紅色反響線條〔T〕。

2020/11/329過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合〔免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG〕，而顯出紅色質(zhì)控線條〔R〕。

2020/11/330陰性標(biāo)本則無反響線條，而僅顯示質(zhì)控線條。

2020/11/3314.2.1結(jié)果斷定圖示——卡型2020/11/3324.2.2結(jié)果斷定圖示——條型2020/11/3334.2.3結(jié)果斷定說明陽性結(jié)果：出現(xiàn)質(zhì)控線和反響線兩條紫紅色線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性。陰性結(jié)果：僅出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。無效：不出現(xiàn)質(zhì)控線紅線或僅出現(xiàn)一條反響線紅線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為無效結(jié)果，應(yīng)重試。競爭法的結(jié)果斷定則相反2020/11/3345免疫膠體金技術(shù)的特點(diǎn)簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會(huì)出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時(shí)間更長。結(jié)果易于斷定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：因?yàn)樵摷夹g(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，這決定了它具有很好的特異性。2020/11/3356

膠體金技術(shù)的應(yīng)用2020/11/336

7相關(guān)儀器

噴膜儀儀器參數(shù)

儀器尺寸為：430mmx410mmX360mm

平臺(tái)大小:450mmX70mm

平臺(tái)挪動(dòng)速度:0-330mm/sec

X、Y、Z軸挪動(dòng)誤差:<50um

定位精度:±10umin1axis;±25umin2axis

噴點(diǎn)方式

BJQ3000:非接觸噴點(diǎn)

AJQ3000:非接觸噴點(diǎn)

劃線寬度

BJQ3000:0.50mm/line〔噴點(diǎn)0.20mm/drop〕

AJQ3000:0.5-5mm

最小噴量

BJQ3000:10nl/drop

AJQ3000:1ul/cm

劃線精細(xì)度

BJQ3000:±1%

AJQ3000:±2%2020/11/337切條機(jī)儀器參數(shù):進(jìn)料寬度：≤100mm進(jìn)料長度：不限,可連續(xù)進(jìn)料切割切割寬度：≥1mm,寬度連續(xù)可調(diào)切割寬度設(shè)定位數(shù)：0.01mm切割精度：±0.1mm切割速度：230次/分鐘,速度連續(xù)可調(diào)切條計(jì)數(shù)：單次工作和總工作分別計(jì)數(shù)刀片:日本進(jìn)口,耐磨高碳鋼材料抗靜電裝置：建議選配電源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)×330(W)×260(H)mm2020/11/338它采用抗原與抗體的特異反響將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反響，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。

在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體〔免疫吸附劑〕②酶標(biāo)記的抗原或抗體〔標(biāo)記物〕③酶作用的底物〔顯色劑〕四酶聯(lián)免疫檢測〔ELISA)技術(shù)簡介1.ELISA的原理2020/11/339

測量時(shí)，抗原〔抗體〕先結(jié)合在固相載體上，但仍保存其免疫活性，然后加一種抗體〔抗原〕與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物〔標(biāo)記物〕，此偶聯(lián)物仍保存其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原〔抗體〕反響結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化復(fù)原反響而呈顏色。2020/11/340

其所生成的顏色深淺與欲測的抗原〔抗體〕含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)〔酶標(biāo)儀〕加以測定。其方法簡單，特異性強(qiáng)。2020/11/3412

ELISA的類型2.1雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)展包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。2020/11/3422.2雙抗體夾心法測抗原反響原理和形式與雙抗原夾心法類似。用特異性抗體進(jìn)展包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗原。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗體代替酶標(biāo)抗抗體。2020/11/3432.3間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體〔二抗〕以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。。2020/11/3442.4競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)展測定，可以采用競爭法形式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。2020/11/3452.5捕獲法測IgM抗體2020/11/346

3ELISA的試劑制備及操作以雙抗體夾心法為例2020/11/347獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)參加封閉蛋白溶液以封閉載體外表殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本〔抗原〕形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物加底物進(jìn)展酶催化反響根據(jù)顏色反響的程度進(jìn)展該抗原的定性或定量測定2020/11/3484.特點(diǎn)4.1特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)構(gòu)造和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先別離待檢物。