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文檔簡介
發(fā)酵液的預處理與固液分離第1頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三第二章發(fā)酵液的預處理與固液分離目的分離菌體和其他懸浮顆粒(細胞碎片、核酸和蛋白質的沉淀物);除去部分可溶性雜質和改變?yōu)V液性質,以利于提取和精制的順利進行。意義
從微生物發(fā)酵液或細胞培養(yǎng)液中提取生化物質的第一個必要步驟就是預處理和固液分離,他關系著下道工序的工藝設計。
第2頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三第一節(jié)發(fā)酵液的預處理和固液分離
掌握懸浮液的一般特征和預處理的方法,了解懸浮液的分離過程和分類及常用的過濾法。
(一)、懸浮液的基本特征
(二)、懸浮液的預處理
(三)、懸浮液分離過程和分類
(四)、過濾法
第3頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三一、發(fā)酵液的基本特征細菌及某些放線菌菌體細小,發(fā)酵液粘度大,不能直接過濾。由于菌體自溶,核酸、蛋白質及其它有機粘性物質的存在會造成濾液渾濁,濾速極慢。發(fā)酵液中雜質很多,其中對提煉影響最大的是高價無機離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+
)和雜蛋白質等。第4頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三二、發(fā)酵液的預處理采用理化方法設法增大懸浮液中固體粒子的大小、或降低粘度,以利于過濾。去除會影響后續(xù)提取的高價無機離子和雜蛋白質等。第5頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
預處理的方法1,高價無機離子的去除方法2,雜蛋白質的去除3,發(fā)酵液的凝聚和絮凝第6頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三1高價無機離子的去除方法鈣離子,可用草酸,反應生成的草酸鈣能促使蛋白質凝固,提高濾液(也稱為原液)質量.鎂離子,可用三聚磷酸鈉它和鎂離子形成可溶性絡合物,用磷酸鹽處理,也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。
Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na黃血鹽與鐵離子形成普魯土鹽沉淀
3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+第7頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三2雜蛋白質的去除方法熱變性沉淀大幅度改變pH加有機溶劑第8頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
雜蛋白質的去除方法熱變性變性蛋白質溶解度較小。最常用的使蛋白質變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低,加快過濾速度。該法只適用于對熱較穩(wěn)定的生化物質。第9頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
雜蛋白質的去除方法沉淀蛋白質在某一pH下,凈電荷為零,溶解度最小,稱為等電點。由于羧基的電離度比氨基大,故蛋白質的酸性性質通常強于堿性,因而很多蛋白質的等電點都在酸性范圍內(pH4.0-5.5)。在酸性溶液中,蛋白質能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀。在堿性溶液中,能與一些陽離子,如Ag,Ca2+、Mg2+、Fe3+和Pb等形成沉淀。第10頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
雜蛋白質的去除方法大幅度改變pH在抗生素生產中,常將發(fā)酵液pH調至偏酸性范圍(pH2-3)或較堿性范圍(pH8一9)使蛋白質凝固第11頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
雜蛋白質的去除方法加有機溶劑加有機溶劑使蛋白質變性的方法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。此外,還可以利用吸附作用除去蛋白質。例如,四環(huán)類抗生素生產中,采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀[K2Zn3Fe(CN)5]
2的膠狀沉淀來吸附蛋白質。第12頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三3發(fā)酵液的凝聚和絮凝凝聚和絮凝技術能有效地改變細胞、菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態(tài),使聚集起來,增大體積,以便于過濾,常用于菌體細小而且粘度大的發(fā)酵液的預處理中。絮凝技術預處理發(fā)酵液的優(yōu)點不僅在于過濾速度的提高,還在于能有效地去除雜蛋白質和固體雜質,如菌體、細胞和細胞碎片等,提高了濾液質量第13頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三3發(fā)酵液的凝聚和絮凝凝聚是在中性鹽作用下,由于雙電層排斥電位的降低,而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下,基于架橋作用,使膠粒形成粗大的絮凝團的過程,是一種以物理的集合為主的過程。第14頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵液的凝聚原理通常發(fā)酵液中細胞或菌體帶有負電荷,由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒子(即正離子)被吸附在其周圍,在界面上形成了雙電層。但是這些正離子還受到使它們均勻分布開去的熱運動的影響,具有離開膠粒表面的趨勢,在這兩種相反作用的影響下,雙電層就分裂成兩部分,第15頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵液的凝聚原理在相距膠核表面約一個離子半徑的平面以內,正離子被緊密束縛在膠核表面,稱為吸附層或緊密層
在平面以外,剩余的正離子則在溶液中擴散開去,距離越遠,濃度越小,最后達到主體溶液的平均濃度,稱為擴散層。這樣就形成了擴散雙電層的結構模型,如圖所示。第16頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三第17頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三當膠粒在溶液中作相對運動時,總有一薄層液體,隨著它一起滑移,這一薄層,厚度比吸附層稍大,滑移(剪切面)在圖中用波紋線表示。
第18頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三這三種電位中只有ζ電位能實際測得,所以可以認為它是控制膠粒間電排斥作用的電位,用來表征雙電層的特征,并作為研究凝聚機理的重要參數(shù)。膠粒能保持分散狀態(tài)的原因主要是帶有相同電荷和擴散雙電層的結構,一旦由于布朗(Brown)運動使粒子間距離縮小到它們的擴散層部分重疊時,即產生使兩個粒子分開的排斥力,從而阻止了粒子的聚集。ζ電位越大,電排斥作用就越強,膠粒的分散程度也越大,第19頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵液的凝聚原理此外,由于膠粒表面的水化作用,形成了包圍于粒子周圍的水化層,也能阻礙膠粒間的直接聚集。但是,水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起的,一旦ζ電位降低或消除,水化層也會隨之減弱或消失。第20頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵液的凝聚原理根據(jù)靜電學基本定理,可導出ζ電位的基本公式為:ζ=4πqδ/D其中D—水的介電常數(shù);q—膠體的電動電荷密度,即滑移面上的電荷密度;δ—擴散層的有效厚度可知,ζ電位與擴散層厚度δ和電荷密度q成正比,而擴散層厚度又與溶液中離子強度有關,當雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華引力時,由于熱運動的結果導致膠粒的互相碰撞而聚集起來。第21頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
方法由此可見,在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質,能降低ζ電位和脫除膠粒表面的水化膜,就能導致膠粒間的凝聚作用。常用的凝聚劑電解質有Al2(SO4)3·18H2O(明礬);AlC13·6H2O;FeC13;ZnSO4;MgCO3等。第22頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵液的絮凝原理絮凝作用有機高分子聚合物絮凝劑,它們具有長鏈線狀的結構,是一種水溶性的聚合物,分子量可高達數(shù)萬至一千萬以上,在長的鏈節(jié)上含有相當多的活性功能團,可以帶有多價電荷(如陰離子或陽離子),也可以不帶電性(如非離子型)。它們通過靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用,強烈地吸附在膠粒的表面,一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上,產生了架橋聯(lián)接,生成粗大的絮團,這就是絮凝作用。第23頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
方法目前最常見的高分子聚合物絮凝劑是有機合成的聚丙烯酰胺類衍生物。根據(jù)活性基團在水中解離情況不同,可分為非離子型、陰離子型(含有羧基)和陽離子型(含有胺基)三類。
聚丙烯酰胺類絮凝劑具有用量少,絮凝體粗大,分離效果好,絮凝速度快以及種類多等優(yōu)點,所以適用范圍廣。第24頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三它們的主要缺點是存在一定的毒性,特別是陽離子型聚丙烯酰胺,要考慮這些物質最終能否從產品中去除。近年來還發(fā)展了聚丙烯酸類陰離子絮凝劑,它們無毒,可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。還有聚苯乙烯類衍生物及無機高分子聚合物絮凝劑,如聚合鋁鹽和聚合鋁鐵鹽等。除此以外,也可采用天然有機高分子絮凝劑。如多聚糖類膠粘物,海藻酸鈉,明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。第25頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
方法對于帶負電性菌體或蛋白質來說,陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低粒子排斥電位和產生吸附架橋的雙重機理,所以可以單獨使用。第26頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
方法對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑,則主要通過分子間引力和氫鍵作用產生吸附架橋,它們常與無機電解質凝聚劑搭配使用。首先加入無機電解質,使懸浮粒子間的相互排斥能降低,脫穩(wěn)而凝聚成微粒,然后,再加入絮凝劑。無機電解質的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件,從而,提高了絮凝效果。這種包括凝聚和絮凝機理的過程,常稱為混凝。第27頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三第28頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
影響絮凝的因素絮凝劑的添加量發(fā)酵液的pH絮凝劑的分子量攪拌轉速攪拌時間第29頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三絮凝劑加量對絮凝效果(濾速)的影響
料液中,絮凝劑濃度增加有助于架橋充分,但是過多的加量反而會引起吸附飽和,在每個膠粒上形成覆蓋層而使膠粒產生再次穩(wěn)定現(xiàn)象第30頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵液pH對陰離子聚丙烯酰胺絮凝效果的影響
溶液pH的變化常會影響離子型絮凝劑中功能團的電離度,從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大,由于鏈節(jié)上相鄰離子基團間的電排斥作用,而使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範顟B(tài),所以架橋能力提高。第31頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
二、發(fā)酵液的過濾微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。在過濾操作中,要求濾速快,濾液澄清并且有高的收率。第32頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三1、影響過濾速度的因素過濾速度和以下因素有關菌種。發(fā)酵條件。培養(yǎng)基的組成未用完的培養(yǎng)基消沫油發(fā)酵周期第33頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
菌種對過濾速度影響真菌的菌絲比較粗大,如青霉菌的菌絲直徑可達10μm,發(fā)酵液容易過濾,不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物,很容易從濾布上刮下來,故可采用鼓式真空過濾機過濾。放線菌發(fā)酵液菌絲細而分枝,交織成網(wǎng)絡狀。如鏈霉素發(fā)酵液菌絲僅0.5~1.0μm左右,還含有很多多糖類物質,粘性強,過濾較困難,一般需經(jīng)預處理,以凝固蛋白質等膠體。細菌發(fā)酵液的菌體更細小,因此,過濾十分因準,如不用絮凝等方法預處理發(fā)酵液,往往難以采用常規(guī)過濾的設備來完成過濾操作。第34頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三培養(yǎng)基的組成對過濾速度影響用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會使過濾困難;發(fā)酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基也會使過濾困難。第35頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三發(fā)酵周期對過濾的影響
正確選擇發(fā)酵終了時間對過濾影響很大。在菌體絲自溶前必須放罐,因為細胞自治后的分解產物一股很難過濾。有時延長發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高,但嚴重影響發(fā)酵液質量,使色素和膠狀雜質增多、過濾困難,最終造成成品質量降低。第36頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三2、改善過濾性能的方法等電點蛋白質變性吸附凝聚和絮凝加入助濾劑直接在發(fā)酵液中形成填充-凝固劑酶解作用第37頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
過濾助劑助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒,它能使濾餅疏松,濾速增大。過濾助劑可解決兩個問題濾餅的可壓縮性問題小粒子如菌絲碎片和細菌細胞,會滲入到轉鼓真空過濾預覆蓋層內部。使得預覆蓋層的部分孔被堵塞,影響了滲透性。加入助濾劑可以解決這一問題常用的過濾助劑硅藻土、珍珠巖、磨碎的木漿、淀粉第38頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三助濾劑的加入有兩種方法:在濾布上預先鋪一層助濾劑(1~2mm),該方法,會使濾速降低,但濾液透明度直接加入發(fā)酵液中(助濾劑的用量,有一條經(jīng)驗規(guī)則可供參考,即助濾劑用量若等于懸浮液中固體含量時,濾速最快。)第39頁,共44頁,2023年,2月20日,星期三
填充-凝固劑改善過濾性能較好的方法是加入一些反應劑,它們能相互作用,或和某些溶解性鹽類發(fā)生反應生成不溶解的沉淀(CaSO4,AlPO4等)。生成
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