基因治療GeneTherapy的研究概況及前景展望

(GeneTherapy)的研究概況及前景展望摘要：基因治療(GeneTherapy)是一種新的治療手段，也是基因工程在應用領域一項較為常見的技術。主要是指向靶細胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段,以糾正或補償基因的缺陷,關閉或抑制異常表達的基因，從而達到治療遺傳性或感染性疾病的目的[1]它可以治療多種疾病，包括癌癥、遺傳性疾病、傳染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌癥基因治療是基因治療的主要應用領域。過去幾年里，全球基因治療臨床試驗取得了很大的進步。實際上，基因治療也遇到了很多困難。未來，基因治療的主要目標是發(fā)展安全和高效的基因?qū)胂到y(tǒng)，它們能將外源遺傳物質(zhì)靶向性地導入到特異的細胞。本文主要介紹基因治療的基本概念、基本方法及面臨的主要問題，就基因轉(zhuǎn)移的載體、基因表達的調(diào)控、基因治療的安全性等方面的研究進展進行綜述和評價，并探討今后基因治療的發(fā)展方向。關鍵詞:基因治療；基因?qū)胂到y(tǒng)；基因表達調(diào)控；安全性；發(fā)展方向21世紀是生物科學與生物技術的世紀，隨著轉(zhuǎn)基因技術、反義核酸技術、RNAi技術等基因操作方法的發(fā)展與完善，采用分子生物學手段治療遺傳疾病、腫瘤、心血管和代謝性疾病等已成為本世紀的一大熱點領域⑵。從1990年美國FDA批準第1項人類基因治療的臨床試驗方案至今，基因治療的研究已經(jīng)走過了20年余的歷程，其研究迅速發(fā)展，已取得很多突破，但仍處于比較幼稚的階段，還不能成為臨床常規(guī)的治療手段［3］。目前，治療已成為一項跨世紀工程，越來越多的受到科學界的關注，已有少數(shù)有確切療效的臨床試驗?，F(xiàn)將基因治療及其研究的現(xiàn)狀綜述如下。1基因治療的簡介及概況基因治療的概念經(jīng)典的基因治療指在基因水平上對遺傳缺陷進行糾正。但臨床實踐表明，基因治療在后天獲得性疾病如腫瘤等方面的應用，要遠多于先天性疾病，所以現(xiàn)在基因治療已轉(zhuǎn)變?yōu)?為達到治療目的而在基因水平進行的操作?；蛑委熞褟膶位蛉毕菪赃z傳病的基因替代治療，拓展至對致病基因的修正和基因增強治療,以及采用外源調(diào)理性細胞因子基因、核酶類及反義核酸類基因藥物進行治療⑷。1.2基因治療的種類⑸基因治療根據(jù)靶細胞的類型可分為生殖細胞(germcell)基因治療和體細胞(somaticcell)基因治療。從理論上講，體細胞基因治療只涉及體細胞的遺傳轉(zhuǎn)變,不影響下一代,現(xiàn)已被廣泛接受做為嚴重疾病的治療方法之一,在現(xiàn)代倫理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取得了可喜的成果。根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑可將基因治療分為invivo(活體直接轉(zhuǎn)移,或稱一步法)和exvivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法)。前者指將含外源基因的重組病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA直接導入體內(nèi)。后者通過選擇適當?shù)陌屑毎?在體外進行基因轉(zhuǎn)移,篩選可表達外源基因的細胞,再將這些細胞轉(zhuǎn)移至體內(nèi)。體內(nèi)法則是直接在體內(nèi)改變與修復遺傳物質(zhì)，目前對其研究日益增多，可能將成為基因治療最有前途的方法。基因治療的策略根據(jù)宿主病變的不同，基因治療的策略也不同,概括起來主要有下列四種：⑴基因替代(genereplacement)，去除整個變異基因，用有功能的正常外源基因取代之，使致病基因得到永久地更正。(2)基因修正(genecorrection)，指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。(3)基因增強(geneaugmentation)，指將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?目的基因的表達產(chǎn)物可以補償缺陷細胞的功能或使原有的功能得到加強。(4)基因抑制(geneconstraint)和基因失活(geneinactivation)，導入外源基因去干擾、抑制有害的基因表達?；蛑委煹幕经h(huán)節(jié)目的基因的選擇用于基因治療的目的基因選擇原則為:(1)該基因的異常是疾病發(fā)生的根源；(2)該基因遺傳的分子機制清楚；(3)基因已被克隆,一級結(jié)構和表達調(diào)控機制較為清楚；(4)可在體外操作,而且安全有效；(5)轉(zhuǎn)移基因在受體細胞內(nèi)最好能夠完整地、穩(wěn)定地整合并能適時適量表達功能性蛋白質(zhì)。隨著分子生物學與基因重組技術的發(fā)展，基因獲取的手段也逐步成熟。目前，獲取目的基因的主要方法有利用分子生物學手段分離和克隆目標基因，如利用酶切或逆轉(zhuǎn)錄等方法，或采用人工手段合成目的基因片段。靶細胞的分離與體外培養(yǎng)靶細胞(又稱受體細胞)是接受外源基因的細胞，來源于被治療的對象。合適的靶細胞是基因治療成敗的關鍵之一，選擇時應考慮疾病的性質(zhì)和部位，炫彩的容易程度，便于體外培養(yǎng)和遺傳操作，以及要有可行的轉(zhuǎn)移方法。根據(jù)疾病的性質(zhì)、基因治療的策略，靶細胞可以選擇外周血淋巴細胞、骨髓造血干細胞、成肌細胞、成纖維細胞、角質(zhì)細胞、呼吸道上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等?；蜣D(zhuǎn)移系統(tǒng)⑹基因治療載體可分為病毒型和非病毒型兩類。病毒型載體包括:逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和疤疹病毒，目前最有效的方法是使用經(jīng)過改造的、具有穿膜特性的病毒作為載體，定向地將目的基因?qū)爰毎?。然而由于人體自身具有抗病毒的免疫系統(tǒng)，使用病毒載體作為媒介來傳遞DNA時就不得不面對宿主的免疫反應。非病毒型載體包括:脂質(zhì)體、裸露DNA和DNA包裝顆粒,范圍從裸DNA顯微注射，電激法、基因槍技術等各類物理學方法到聚陽離子賴氨酸或陽離子脂質(zhì)體。1.4.4目的基因的表達與調(diào)控早期基因治療的疾病主要選擇如肺囊性纖維化、ADA-SCID等遺傳缺陷性疾病,治療基因?qū)塍w內(nèi)后即使不進行精確的調(diào)控也可獲得較好療效。而在用基因治療其它多種疾病時，對目的產(chǎn)物的需要量要求嚴格，若目的基因表達由載體或病毒啟動子自發(fā)激活,表達不受控制，目的產(chǎn)物表達過度或不適當，不僅對疾病治療不利，甚至可能引起致命的副作用，如糖尿病的胰島素基因治療、腎性貧血的EPO基因治療等。目的基因表達的組織、時序及水平上的嚴格調(diào)控是這類基因治療進入臨床前必需解決的問題，即如何有效地調(diào)控外源基因在體內(nèi)的表達，使其控制在適度水平。目前為止，外源基因?qū)氩⒃诎屑毎斜磉_已獲得成功，但外源基因的表達量與生理水平卻依舊有較大差距。因此，外源基因的表達與調(diào)控是目前基因治療的難點與研究熱點。目前人們正在通過定點插入以及連接強啟動子等方法來提高導入基因的表達水平⑺。2基因治療的應用現(xiàn)狀基因治療在臨床上的應用[5,8]單基因疾病從1990年第1例SCID-ADA基因治療方案至今，已有18種單基因遺傳病開展了基因治療臨床試驗。主要為肺囊性纖維化、戈歇病、血友病、a-抗胰酶缺失和嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID-ADA、SCID-X)等。Marina等進行了SCID-X的H期臨床試驗，通過體外逆轉(zhuǎn)錄病毒介導細胞因子YC受體基因轉(zhuǎn)導患者造血干細胞，然后回輸,結(jié)果從T、B、NK淋巴細胞的數(shù)量、功能以及抗原特異性反應方面均達到了與正常人相當?shù)某潭?且患者已能正常生活。單基因遺傳病基因治療的關鍵是外源基因能在體內(nèi)長期穩(wěn)定的表達。因此，選擇合適的轉(zhuǎn)移載體以及合適的靶細胞十分關鍵。腺病毒具有強的免疫原性，且其介導的外源基因不能整合，可能難以達到長期穩(wěn)定表達的要求。雖然Marina等成功地運用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但由于其滴度及轉(zhuǎn)導效率較低，只適于體外轉(zhuǎn)導，因而需要進一步改進。研究人員認為,免疫原性低、可感染多種分裂相和非分裂相細胞、能夠整合且適于體內(nèi)轉(zhuǎn)導的腺相關病毒和慢病毒，可能是治療單基因遺傳病的理想載體。惡性腫瘤幾種腫瘤治療的途徑正在研究中。首先是增強腫瘤的免疫反應；第二是導入腫瘤細胞“自殺(suicide)”基因;第三抑制腫瘤細胞的生成，如導入抗癌基因和癌基因的反義基因。研究表明多種細胞因子如白細胞介素2(IL-2)、IL-4、腫瘤壞死因子(TNF)、Y-干擾素等基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，或腫瘤組織浸潤的淋巴細胞(TIL)等,經(jīng)擴增后輸回人體，可以促進腫瘤抗原和MHC(主要組織相容性復合物)的表達，增強機體免疫反應的能力。另一進展是將MHC-I型基因用脂質(zhì)體包裹直接導入腫瘤內(nèi)以提高免疫反應。免疫組化證實,經(jīng)這樣處理后緩解的腫瘤內(nèi)有大量CD8+T細胞,提示該機制是CD8+T細胞介導的免疫排斥反應?！凹毎詺ⅰ鄙婕安迦雴渭儼捳畈《镜男叵俸塑账峒っ?TK)基因。其原理為HSV-TK可將一種核酸類似物抗病毒藥物gancyclovier(GCV)磷酸化成一種細胞毒藥物,干擾靶細胞DNA合成,選擇性殺死分裂細胞。Culver等將HSV-TK基因?qū)肽孓D(zhuǎn)錄病毒載體,讓其在包裝細胞中復制包裝。然后把轉(zhuǎn)染后的包裝細胞直接注入膠質(zhì)瘤,一周后給GCV,使腫瘤基本消失。抑癌基因p53已被FDA批準治療非小細胞肺癌患者,該病為p53基因缺陷。此外反義K-rasDNA已被注射到肺癌患者體內(nèi)，試圖抑制已活化的癌基因活性。AIDSAIDS是由HIV感染引起的。HIV是一個逆轉(zhuǎn)錄病毒,與靶細胞膜上的CD4分子結(jié)合后進入細胞,HIV基因組RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后整合至宿主染色體。HIV感染的基因治療的策略主要有抗病毒基因治療(細胞內(nèi)免疫)和基因免疫治療兩方面。前者指將人工構建的一個重組基因?qū)胍赘屑毎麅?nèi)，該重組的基因可在轉(zhuǎn)染細胞中表達病毒基因的反義核酸或病毒蛋白的突變體，以便有效地干擾野生病毒的復制和增殖。如對HIV蛋白的基因修飾、反義RNA和核酶(ribozyme)等。后者包括體內(nèi)直接注射DNA(基因免疫接種)，以及轉(zhuǎn)移針對HIV-1抗原特異性的攜帶自殺基因的CD8+T細胞，以治療HIV感染。此外，阻斷HIV和CD4結(jié)合也是治療HIV感染的策略之一，即將重組的可溶性CD4基因直接注射或?qū)塍w外培養(yǎng)的人T細胞再輸回體內(nèi)?；蛑委熢谄渌I域中的應用幾種釋放激素、凝血因子、抗凝血劑和其它治療因子的系統(tǒng)正用于基因治療。當這些基因被導入成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞后，他們的表達產(chǎn)物可在血液中檢測到。最近對小鼠的研究結(jié)果表明，成肌細胞是釋放重組蛋白的最佳靶細胞,它們可與鄰近的肌纖維隨機融合,并成為血管平滑肌組織中的一部分。如通過這種方式導入的人生長激素基因的小鼠，可在循環(huán)血液中檢測出表達產(chǎn)物達6個月之久。通過體外基因轉(zhuǎn)移制備工程細胞，將其植入腦內(nèi)，也正用于慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療，以恢復功能。如果這種基因轉(zhuǎn)移/移植的聯(lián)合技術被證明有效的話,則將提供一個治療諸如帕金森氏病和早老性癡呆等癥的新方法。3基因治療中存在的問題及前景存在的問題基因治療應用到臨床只有短短幾年,雖然它對基礎醫(yī)學或臨床醫(yī)學的發(fā)展均起到了推動作用，但應清醒地看到，目前的基因治療尚存在許多問題。基因治療本身存在的問題盡管現(xiàn)代科技的發(fā)展使得基因治療日趨完善，但其仍存在目的基因少、缺乏高效的載體系統(tǒng)以及目的基因表達的可控性差等問題。因此，研究疾病的發(fā)病機制，更好地了解致病基因及其作用機理；提高基因轉(zhuǎn)移的效率、靶向性和安全性；深入研究基因的表達及其調(diào)控；建立良好的實驗動物模型，為臨床應用提供更可靠的數(shù)據(jù)等是目前基因治療研究中應當著力解決的問題⑼。倫理問題基因治療價格昂貴，并不是每個公眾所能享受的，這一點與醫(yī)學是一種社會公益性福利事業(yè)的本質(zhì)是相違背的。另外，就生殖細胞的基因治療而言，基因治療將改變性細胞中的DNA序列，并將這種改變傳遞給后代。同時，基因治療還會加大老齡化程度，進而加重社會負擔。除此之外，基因治療還涉及患者知情權以及隱私問題等⑼。安全性問題基因治療的安全性是指基因治療應確保不因外源基因的導入而引起新的有害遺傳變異，因此，在進行基因治療時選擇一個安全有效的載體是相當關鍵的，載體不當引起的插入突變可能引發(fā)一個重要基因的失活，或者激活一個原癌基因，后果不堪設想。同時導入的外源基因一般不具有表達調(diào)控系統(tǒng)，其表達水平的高低可能會影響機體的一些生理活動。此外，轉(zhuǎn)基因動物的成功使生殖細胞的基因治療成為可能，但這種治療所帶來的遺傳特征的變化是否會世代相傳，這個問題科學界仍持有不同的態(tài)度。前景展望基因治療將是醫(yī)學史上的一次革命,因為人自己、甚至人的疾病組織（如腫瘤）本身成為“基因工程的藥廠”，生長出的藥物（基因產(chǎn)物）治療人的疾病。但是，關鍵問題是何時才能實現(xiàn)［10］。不能否認過去幾十年基因治療取得的巨大成就，它已被看成是對先天和后天基因疾病的潛在有效的治療方法,并建立起安全有效的調(diào)控體系。從相對完善的動物實驗過渡到臨床治療實驗階段，經(jīng)改進的基因轉(zhuǎn)導系統(tǒng)顯然要比傳統(tǒng)方法更加安全。然而正當基因治療展現(xiàn)出美好前景時,對它的懷疑和信任相互之間的爭論愈加激烈，懷疑常處于上風。盡管目前對于基因治療還有許多技術難題有待解決，但可以相信：隨著人類基因組計劃（通過破譯人體10萬個基因的全部核苷酸序列及搞清它的結(jié)構和功能）的實施,基因表達調(diào)控機制的闡明，以及轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因方法的完善,基因治療必將成為21世紀人類攻克疑難病癥的一種常規(guī)治療手段［11］。參考文獻［1］張嬋，邵艷軍.基因治療的病毒載體系統(tǒng).生物技術.2007,17（1）:91［2］陶銘.基因治療及其研究仃］.生物學通報，2008,43（4）：16-18.［3］陳詩書，戴冰冰.基因治療的研究現(xiàn)狀與評價J］.中華腫瘤雜志，2002，24(4)：313-315.[4]刁勇，王廣基，許瑞