實(shí)驗(yàn)大腸桿菌半乳糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)

辦公地點(diǎn)：生物樓117；電話(huà)：；Email:現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容?

染色體步移法克隆已知序列的側(cè)翼序列?轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變及目的表型的篩選?大腸桿菌β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)?利用SDS分析融合蛋白的可溶性?綠色糖單胞菌的發(fā)酵及孢外酶的提取大腸桿菌β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)張妙直乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因ipozya控制單元操縱基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子阻遏物?-半乳糖苷酶透性酶乙?；D(zhuǎn)移酶負(fù)調(diào)控模型誘導(dǎo)物：乳糖或IPTG實(shí)驗(yàn)原理操縱基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子?-半乳糖苷酶透性酶乙酰基轉(zhuǎn)移酶操縱子正調(diào)控模型cAMP-CAP復(fù)合物CAP結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因ipozya控制單元實(shí)驗(yàn)原理大腸桿菌β-半乳糖苷酶是一類(lèi)誘導(dǎo)酶?無(wú)作用底物(乳糖或半乳糖苷)時(shí)，幾個(gè)分子/細(xì)胞；?

中性培養(yǎng)基中加入乳糖(誘導(dǎo)物)，103~105倍；?

IPTG，不被分解，比乳糖提高~3倍；?

葡萄糖效應(yīng)：葡萄糖和IPTG，被顯著阻遏；?

葡萄糖+IPTG+cAMP，不受葡萄糖影響。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料菌株

大腸桿菌(E.coliK12)2.培養(yǎng)基及試劑(1).基本培養(yǎng)基(M9培養(yǎng)基)KH2PO430g；Na2HPO460g；NaCl5g；NH4Cl10g。

溶解后加水至1L，121℃滅菌20min。滅菌后，在100mlM9中加入：0.1mol/LMgSO410ml,0.01mol/LCaCl210ml,加無(wú)菌水至1L，作為基本培養(yǎng)基。(2).2×YT培養(yǎng)基蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl5g，加去離子水至1L。(3).Z緩沖液

每升含有一下成分：Na2HPO4·12H2O(0.06mol/L)21.5gNaH2PO4·2H2O(0.04mol/L)6.2gKCl(0.04mol/L)(0.01mol/L)0.75gMgSO4·7H2O(0.001mol/L)0.246g巰基乙醇(0.05mol/L)2.7mlpH7.0(4).其他試劑10%甘油，10%乳糖，10%葡萄糖，IPTG(200mg/ml),ONPG(4mg/ml),1mol/LNa2CO30.1%SDS,氯仿3.主要儀器

可見(jiàn)光分光光度計(jì)，搖床2.酶的誘導(dǎo)合成及其調(diào)控分組進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后全班集中整理出總的實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組：A.25ml基本培養(yǎng)基的三角瓶

B.21個(gè)2ml離心管，加入20μl0.1%SDS和40μl氯仿，蓋嚴(yán)后至于冰??；C.10個(gè)2ml離心管，測(cè)OD600.第一組：乳糖對(duì)β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)(1).往25ml基本培養(yǎng)基的三角瓶中加1ml10%的甘油；(2).接種25ml生長(zhǎng)在甘油培養(yǎng)基18h的菌液，計(jì)時(shí)，

并取1ml測(cè)OD600；(3).30℃水浴搖床振蕩培養(yǎng)1h，取1ml并測(cè)OD600值。

然后向培養(yǎng)基瓶中加1ml10%的乳糖，搖勻并開(kāi)始

計(jì)時(shí)。立即取出500μl培養(yǎng)液到含有SDS和氯仿的小

離心管中，至于冰浴中，此管為0min樣品。培養(yǎng)瓶

繼續(xù)在30℃水浴搖床振蕩培養(yǎng)；(4).每5min取500μl培養(yǎng)液用于測(cè)定β-半乳糖苷酶活

性，共取10次，然后每10min取樣一次，共10次。(5).每20min取1ml樣品測(cè)OD600值注意：取樣離心管要編號(hào)，并記錄取樣時(shí)間。3.β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定(1).將上述含樣品的小離心管從冰浴中取出，置于30℃水浴中平衡10min；(2).在每個(gè)小離心管中分別加入500μlZ緩沖液和200μl底物ONPG(4mg/ml)，反應(yīng)一直到黃顏色

出現(xiàn)，加入500μl1mol/LNa2CO3溶液終止反應(yīng)（計(jì)時(shí)）(3).離心后取上清測(cè)OD420，值在0.2-0.8范圍內(nèi)，測(cè)

定的結(jié)果較為可靠。4.β-半乳糖苷酶力單位和比活力本實(shí)驗(yàn)把在pH7.0的緩沖液中，30℃保溫酶解，每分鐘釋放出1μmolONP的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位。酶活力單位(U/ml)=OD420反應(yīng)時(shí)間(min)×酶液體積(0.5ml)×1.1式中：1.1是ONP的微摩爾消光系數(shù)酶比活力=OD600每毫升菌液酶活力單位(U/ml)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將結(jié)果記錄下表，并以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，β-半乳糖苷酶比活力為縱坐標(biāo)繪圖。為便于比較，將5組曲線圖繪制在同一坐標(biāo)紙上，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。組別取樣時(shí)間菌液