高效液相色譜基本原理

高效液相色譜基本原理演示文稿當(dāng)前1頁，總共46頁。高效液相色譜基本原理當(dāng)前2頁，總共46頁。1）高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測器—10-11g。2）HPLC與GC的比較分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的80%。流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。當(dāng)前3頁，總共46頁。極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量3）應(yīng)用由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機物等分析，大多是通過HPLC來完成的。右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對象當(dāng)前4頁，總共46頁。二、HPLC儀器HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;進樣系統(tǒng);分離系統(tǒng);檢測系統(tǒng);此外還配有梯度淋洗、自動進樣和數(shù)據(jù)處理裝置。其工作過程如圖所示。當(dāng)前5頁，總共46頁。He儲液瓶分布器過濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計注樣閥分離柱到檢測器當(dāng)前6頁，總共46頁。1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進行泵內(nèi)。當(dāng)前7頁，總共46頁。2）溶劑脫氣系統(tǒng)：為什么需要脫氣防止在檢測器中產(chǎn)生氣泡，引起噪音。除去氧氣的影響。超聲波脫氣真空加熱脫氣He氣鼓泡脫氣在線脫氣機脫氣

溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。當(dāng)前8頁，總共46頁。當(dāng)前9頁，總共46頁。在線真空脫氣和He脫氣對保留時間在現(xiàn)性的影響當(dāng)前10頁，總共46頁。3）泵：

對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。恒壓泵(類似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動時，會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機械注射式和機械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機械往復(fù)式恒流泵(見下圖。每分鐘往復(fù)25~100次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時可連接一脈動阻尼器)。當(dāng)前11頁，總共46頁。串聯(lián)泵單元泵原理當(dāng)前12頁，總共46頁。單元泵工作原理AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired)Damper阻尼器Seal密封墊Piston活塞桿BallScrewDriveGearOutletBallValve出口單向閥ActiveInletValve入口單向閥Purgevalve沖洗閥當(dāng)前13頁，總共46頁。溶劑傳輸系統(tǒng)工作原理往復(fù)活塞泵(單向閥)（密封金墊）GoldSealSapphireInsertRubyBallSpringInsert入口出口自溶劑瓶至液相系統(tǒng)當(dāng)前14頁，總共46頁。4）梯度洗脫裝置：在分離過程中逐漸改變流動相組成的裝置。如果只有一個泵，可采用低壓混合設(shè)計（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。當(dāng)前15頁，總共46頁。低壓梯度當(dāng)前16頁，總共46頁。高壓梯度當(dāng)前17頁，總共46頁。當(dāng)前18頁，總共46頁。2.進樣系統(tǒng)進樣裝置包括兩種：1）手動進樣器：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。裝入樣品出口進樣采樣環(huán)泵入溶劑進色譜柱當(dāng)前19頁，總共46頁。ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWaste手動進樣器－六通閥當(dāng)前20頁，總共46頁。當(dāng)前21頁，總共46頁。2）自動進樣器當(dāng)前22頁，總共46頁。工作原理當(dāng)前23頁，總共46頁。當(dāng)前24頁，總共46頁。3.色譜柱1）對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：平衡密度法：即使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：當(dāng)采用粘度較大的試劑，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。填充方法：填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進入(影響填充均勻性)。當(dāng)前25頁，總共46頁。0.090in.0.130in.0.090in.0.170in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090in.0.080in.當(dāng)前26頁，總共46頁。柱溫箱當(dāng)前27頁，總共46頁。當(dāng)前28頁，總共46頁。當(dāng)前29頁，總共46頁。當(dāng)前30頁，總共46頁。當(dāng)前31頁，總共46頁。4.檢測器液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測器等。1）紫外檢測器其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是，此時所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10L。HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測器應(yīng)用很廣。

在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液當(dāng)前32頁，總共46頁。LampOpticalmirrorsGratingDetectorcellSlitBeamsplitter當(dāng)前33頁，總共46頁。TungstenlampLensDeuteriumlampLenssystemHolmiumfilterDetectorcellOpticalslitGratingDiodeArray當(dāng)前34頁，總共46頁。TimeWavelengthmsecnmLIGHTSHIFTREGISTERSWITCHVIDEOLINEREADOUTCYCLEPHOTODIODECAPACITORTRANSISTOR當(dāng)前35頁，總共46頁。當(dāng)前36頁，總共46頁。當(dāng)前37頁，總共46頁。TakepeakspectrumComparewithlibraryMatch:998Chlortoluron?250300Wavelength(nm)250300Wavelength(nm)*LibrarySearchingmaybeperformedinanautomatedfashion.SpectralLibraries:Principle當(dāng)前38頁，總共46頁。2）熒光檢測器許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級。當(dāng)前39頁，總共46頁。當(dāng)前40頁，總共46頁。3）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑