經(jīng)典液相色譜法

第十一章經(jīng)典液相色譜法當(dāng)前1頁(yè)，總共51頁(yè)。液相色譜法（LC）：以液體為流動(dòng)相的色譜法回顧液相色譜柱色譜法平面色譜法紙色譜法薄層色譜法當(dāng)前2頁(yè)，總共51頁(yè)。一、吸附色譜法1.要求：

固定相→吸附劑（硅膠或Al2O3）具表面活性吸附中心2.分離機(jī)制：利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離吸附系數(shù)注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)

吸附平衡

Xm+nYa→Xa+nYm

第一節(jié)基本原理與分類(lèi)（一）分離原理當(dāng)前3頁(yè)，總共51頁(yè)。一、吸附色譜法3.流動(dòng)相的洗脫能力:與溶劑極性有關(guān)溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)→組分ka越小→柱色譜：tR越短→組分越快流出平面色譜：Rf越大→展開(kāi)越快（展距越長(zhǎng)）

4.洗脫順序

色譜柱一定，Ka大，即極性越強(qiáng)的組分吸附力越強(qiáng)→→→

柱色譜：tR越長(zhǎng)→洗脫慢；反之Ka小，極性越弱組分先被洗脫。平面色譜：Rf越小→展開(kāi)慢；反之Ka小，極性越弱組分展開(kāi)快。當(dāng)前4頁(yè)，總共51頁(yè)。附：常見(jiàn)化合物極性①見(jiàn)登山圖1②雙鍵↑，吸附力↑③分子內(nèi)氫鍵，吸附力↓二甲胺酯酮酰胺醛硫醇胺類(lèi)醇酚羧酸硝基化合物醚烯烴烷烴取代基極性登山圖1當(dāng)前5頁(yè)，總共51頁(yè)。附：常見(jiàn)溶劑極性石油醚環(huán)已烷四氯化碳苯甲苯乙醚氯仿醋酸乙酯正丁醇丙醇乙醇、甲醇水流動(dòng)相極性登山圖2乙腈當(dāng)前6頁(yè)，總共51頁(yè)。（二）固定相-吸附劑常用吸附劑1.硅膠2.氧化鋁3.聚酰胺當(dāng)前7頁(yè)，總共51頁(yè)。1.硅膠（SiO2·xH2O）----極性吸附劑,弱酸性結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵

物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→不易展開(kāi)，K大，Rf越小

吸附活性次序：束縛型＜游離型

硅醚無(wú)活性

2）含水量越大，活性越低，吸附能力越低

加熱失水—活化:

105～110OC

(30分鐘)----(可逆失水)

200OC------(不可逆失水)→活性喪失適用：分析酸性或中性物質(zhì)，如有機(jī)酸、氨基酸、甾體等選擇性保留堿性物質(zhì),如胺類(lèi)硅醚當(dāng)前8頁(yè)，總共51頁(yè)。2.

氧化鋁—強(qiáng)極性吸附劑(一般得拖尾峰)

堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁pH≈7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)3.聚酰胺

氫鍵作用氫鍵能力↑強(qiáng)，組分展開(kāi)越慢應(yīng)用：分離酚、酸、硝基、醌類(lèi)如：黃酮類(lèi)化合物活化溫度:200~400℃(0.5h)應(yīng)用：分離生物堿、揮發(fā)油、萜類(lèi)、甾體、甙、酯、內(nèi)酯等當(dāng)前9頁(yè)，總共51頁(yè)。硅膠含水量%氧化鋁含水量%活性級(jí)別吸附活性(能力)051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ大(強(qiáng))↓↓↓小(弱)4.吸附劑的活性吸附劑含水量越高，吸附活性越低，吸附能力越弱，活性級(jí)數(shù)越大，同一組分和流動(dòng)相，其K越小

加熱失水—活化加水—減活或失活分離極性小的組分—選吸附活性大的吸附劑分離極性大的組分—選吸附活性小的吸附劑當(dāng)前10頁(yè)，總共51頁(yè)。1.分離機(jī)制

利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別實(shí)現(xiàn)分離

狹義分配系數(shù)二、分配色譜法液液分配色譜（LLC）：K與流動(dòng)相的性質(zhì)（極性及種類(lèi)）有關(guān)

氣液分配色譜（GLC）：K與固定相極性和柱溫有關(guān)當(dāng)前11頁(yè)，總共51頁(yè)。1）要求：

固定相—固定液機(jī)械涂漬在惰性載體上的液體（易流失）

化學(xué)反應(yīng)鍵合在載體表面—化學(xué)鍵合相

流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶（LLC）

載體→惰性，性質(zhì)穩(wěn)定

不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)2.固定相和流動(dòng)相2）液液分配色譜的類(lèi)別：

正相分配色譜→固定相極性大于流動(dòng)相反相分配色譜→固定相極性小于流動(dòng)相

正相分配色譜:極性弱的組分先被洗脫反相分配色譜:極性強(qiáng)的組分先被洗脫3)洗脫順序：極性相似相溶當(dāng)前12頁(yè)，總共51頁(yè)。洗脫順序極性大的組分，K小→tR短，先出柱

正相液—液分配色譜

反相液—液分配色譜固定相強(qiáng)極性溶劑:水、醇類(lèi)等弱極性溶劑:辛烷、氯仿等流動(dòng)相強(qiáng)極性化合物弱極性至非極性物質(zhì)極性小的組分，K小→tR短，先出柱分離對(duì)象弱極性溶劑:苯、甲苯、環(huán)己烷等強(qiáng)極性溶劑:緩沖溶液、醇類(lèi)等當(dāng)前13頁(yè)，總共51頁(yè)?；瘜W(xué)鍵合相：

將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面，而構(gòu)成鍵合相。

以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱(chēng)為化學(xué)鍵合相色譜法?；瘜W(xué)鍵合相既有分配作用又有吸附作用※正相鍵合相色譜法如氰基與氨基化學(xué)鍵合相流動(dòng)相用烷烴，加適量極性調(diào)整劑而構(gòu)成※反相化學(xué)鍵合相如十八烷基鍵合相流動(dòng)相常用甲醇—水或乙腈—水當(dāng)前14頁(yè)，總共51頁(yè)。三、離子交換色譜法1.分離機(jī)制：依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同選擇性系數(shù)

注：KA/B越大，A離子交換能力越大，越易保留，tR越長(zhǎng)

以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為例

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

固定離子可交換離子B待測(cè)離子A通式：R-B+A→R-A+B當(dāng)前15頁(yè)，總共51頁(yè)。3.影響保留行為的因素：KA/B與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動(dòng)相性質(zhì)、離子交換樹(shù)脂性質(zhì)以及溫度有關(guān)

1）離子價(jià)態(tài)越高→Ka越大→tR越長(zhǎng)2）價(jià)態(tài)相同，水合離子半徑越小，Ka越大→tR越長(zhǎng)3）交換能力強(qiáng)的離子組成的流動(dòng)相洗脫能力強(qiáng)→tR越短

4）離子強(qiáng)度大的流動(dòng)相洗脫能力強(qiáng)→tR越短2.固定相→離子交換劑經(jīng)典離子交換色譜：離子交換樹(shù)脂HPLC：化學(xué)鍵合離子交換劑

流動(dòng)相→水為溶劑的緩沖溶液當(dāng)前16頁(yè)，總共51頁(yè)。四、分子（空間）排阻色譜法要求：

固定相→多孔性凝膠—凝膠色譜

流動(dòng)相→水——凝膠過(guò)濾色譜(GFC)

流動(dòng)相→有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜(GPC)

分離機(jī)制：根據(jù)被測(cè)組分分子大小的不同分離—分子篩原理滲透系數(shù)Kp

注：Kp僅取決于待測(cè)分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動(dòng)相的性質(zhì)無(wú)關(guān)

Kp=0：尺寸太大全被排阻Kp=1：尺寸太小全被保留0＜Kp＜1當(dāng)前17頁(yè)，總共51頁(yè)?？臻g排阻色譜法的分類(lèi)：1、凝膠滲透色譜法GPC：

分離親脂性物質(zhì)固定相:親脂性凝膠如甲基交聯(lián)葡聚糖凝膠流動(dòng)相:有機(jī)溶劑2、凝膠過(guò)濾色譜法GFC：

分離水溶性物質(zhì)固定相:親水性凝膠如葡聚糖凝膠流動(dòng)相:水當(dāng)前18頁(yè)，總共51頁(yè)。分離對(duì)象：大分子量（＞2000）的化合物

有機(jī)聚合物（如聚烯烴、聚苯乙烯和聚酰胺等）生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸、低聚糖、肽類(lèi)等）局限：不能分離大小相近的化合物為得到良好的分離，組分的分子量應(yīng)相差10%以上。應(yīng)用Kp∝尺寸∝相對(duì)分子質(zhì)量——可應(yīng)用于高分子分子量的測(cè)定當(dāng)前19頁(yè)，總共51頁(yè)。

結(jié)論：四種色譜的分離機(jī)制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡K分別為吸附系數(shù)，狹義分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù)除了凝膠色譜法中的K僅與待測(cè)分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關(guān)外，其他三種K值都受組分的性質(zhì)、流動(dòng)相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫的影響當(dāng)前20頁(yè)，總共51頁(yè)。第三節(jié)平面色譜法分類(lèi)：平面色譜薄層色譜(TLC)紙色譜（PC）薄層電泳法吸附薄層色譜分配薄層色譜分子排阻薄層色譜P236當(dāng)前21頁(yè)，總共51頁(yè)。一、平面色譜參數(shù)（一）定性參數(shù)

1、比移值（Rf）Rf=0:組分在原點(diǎn)，完全被固定相保留Rf=1:組分在前沿，完全不被固定相保留

最佳范圍：0.3-0.5

可用范圍：0.2-0.8LALBL0當(dāng)前22頁(yè)，總共51頁(yè)。討論1）Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開(kāi)劑的性質(zhì)有關(guān)

2）K↑大，Rf↓小3）薄層板一定，對(duì)于極性組分展開(kāi)劑極性↑大，Rf↑大（容易展開(kāi)）展開(kāi)劑極性↓小，Rf↓小（不容易展開(kāi)）☆色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)——薄層色譜定性參數(shù)☆Rf值與組分性質(zhì)、薄層板性質(zhì)、展開(kāi)劑性質(zhì)、展開(kāi)室內(nèi)展開(kāi)劑蒸氣飽和程度、溫度等有關(guān)當(dāng)前23頁(yè)，總共51頁(yè)。續(xù)前2.相對(duì)比移值Rst

討論參考物與被測(cè)組分在完全相同條件下展開(kāi)

可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對(duì)比移值Rst與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1當(dāng)前24頁(yè)，總共51頁(yè)。定義式：R=2d/（W1+W2）=2(L2-L1)/（W1+W2）W1,W2：各斑點(diǎn)直徑完全分離：R≥1.5基本分離：R＝1.0最佳分離：R=2.0（二）分離度薄層掃描圖dW1W2L0當(dāng)前25頁(yè)，總共51頁(yè)。

柱色譜

平面色譜屬性定距洗脫定時(shí)展開(kāi)流動(dòng)相名稱(chēng)保留時(shí)間tR

比移值Rf(展開(kāi)距離)

定性參數(shù)洗脫劑展開(kāi)劑K越小→tR越短洗脫越快展開(kāi)順序K越小→Rf越大展開(kāi)越快當(dāng)前26頁(yè)，總共51頁(yè)。

二、薄層色譜法定義：將固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法薄層板：鋪好固定相層的板特點(diǎn)：1、分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中；2、靈敏度高；3、展開(kāi)時(shí)間短；4、試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單；5、上樣量大；6、儀器簡(jiǎn)單操作方便當(dāng)前27頁(yè)，總共51頁(yè)。（一）吸附薄層色譜法的吸附劑和展開(kāi)劑常用吸附劑1.硅膠2.氧化鋁3.聚酰胺二、薄層色譜法當(dāng)前28頁(yè)，總共51頁(yè)。（二）展開(kāi)劑的選擇（同液固吸附色譜流動(dòng)相選擇）根據(jù)被測(cè)組分、吸附劑和展開(kāi)劑本身的極性當(dāng)前29頁(yè)，總共51頁(yè)。吸附劑和流動(dòng)相的選擇：

依據(jù)被測(cè)組分、吸附劑和流動(dòng)相的性質(zhì)1.被測(cè)組分性質(zhì)（極性大?。?/p>

烴＜--------＜羧酸2.吸附劑的活性：

吸附劑的活性↑大，對(duì)組分的吸附能力↑強(qiáng)，K↑大

強(qiáng)極性物質(zhì)——選擇弱吸附劑弱極性物質(zhì)——選擇強(qiáng)吸附劑3.流動(dòng)相的極性：

流動(dòng)相極性↑大，對(duì)組分的展開(kāi)能力↑大,K↑小

“相似相溶”原則：根據(jù)組分性質(zhì)、吸附劑的活性，選擇適當(dāng)極性的流動(dòng)相當(dāng)前30頁(yè)，總共51頁(yè)。4.三者關(guān)系圖示：

組分吸附劑流動(dòng)相極性活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性5.展開(kāi)順序:

固定相、展開(kāi)劑一定

極性越小者Rf越大,展開(kāi)快極性越大者Rf越小,展開(kāi)慢6.吸附劑活性越大，Rf展開(kāi)劑極性越大，Rf當(dāng)前31頁(yè)，總共51頁(yè)。例.硅膠板分離生物堿，展開(kāi)劑為：環(huán)己烷:丙酮:乙二胺:水=10：5：2：51）環(huán)己烷：弱極性，減弱洗脫能力，增大K，減小Rf2）水：強(qiáng)極性，增強(qiáng)洗脫能力，減小K，增大Rf3）丙酮：中等極性，增加極性與弱極性溶劑間的互溶性4）乙二胺：調(diào)節(jié)pH值，抑制組分離解，減少斑點(diǎn)拖尾。當(dāng)前32頁(yè)，總共51頁(yè)。（二）薄層色譜操作方法1）薄層板的類(lèi)型（1）硬板：加粘合劑—濕法鋪板（2）軟板：無(wú)粘合劑—干法鋪板

1.薄層板的制備2）粘合薄層板（硬板、濕板）的鋪制⑴粘合劑煅石膏：吸附劑的9-15%左右—硅膠-G板羧甲基纖維素鈉CMC-Na：0.5-1%水溶液—硅膠-CMC板當(dāng)前33頁(yè)，總共51頁(yè)。3）鋪板方法（1）傾注法鋪板（2）平鋪法鋪板（3）機(jī)械涂鋪法鋪板4）活化涼干-活化-放冷-干燥器中注意：活化溫度及時(shí)間（105℃，1h）活化的目的（除去水分）當(dāng)前34頁(yè)，總共51頁(yè)。2.點(diǎn)樣1）樣品溶液

避免用水作溶劑，斑點(diǎn)易擴(kuò)散，溶劑不易揮發(fā)一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性溶劑最好用與展開(kāi)劑極性相似的溶劑2）點(diǎn)樣量

幾到幾十微克，點(diǎn)樣直徑不超過(guò)2~3mm間距1.5~2cm端距1~2cm直徑:3mm。幾~幾十微克，少于10μL起始線當(dāng)前35頁(yè)，總共51頁(yè)。3.展開(kāi)(1)展開(kāi)方式:上行展開(kāi)法、近水平展開(kāi)雙向展開(kāi)、同向多次展開(kāi)

軟板——近水平展開(kāi)硬板——上行法(2)展開(kāi)中注意之點(diǎn)a)邊緣效應(yīng)：同一物質(zhì)在同一薄板上展開(kāi)時(shí)兩邊的Rf值與中間部分的Rf值不同b)消除邊緣效應(yīng)的措施：展開(kāi)前充分飽和15~30min展開(kāi)槽內(nèi)壁貼上濾紙條浸濕選小體積展開(kāi)槽當(dāng)前36頁(yè)，總共51頁(yè)。圖示當(dāng)前37頁(yè)，總共51頁(yè)。4.顯色顯色方法1、有色化合物——直接定位2、無(wú)色顯色劑：通用有碘、碘化鉍鉀、溴甲酚綠、硫酸例：分離酸性物質(zhì)

選酸性硅膠板，使用溴甲酚綠為顯色劑紫外吸收紫外燈檢出斑點(diǎn)有熒光熒光板上有暗斑顯色劑定位噴霧顯色蒸氣顯色：碘-生物堿、氨基酸衍生物、肽類(lèi)、脂類(lèi)及皂苷噴霧后加熱顯色★當(dāng)前38頁(yè)，總共51頁(yè)。1）Rf定性（三）定性與定量分析1.定性分析⑴組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)⑵薄層板的性質(zhì)⑶展開(kāi)劑的性質(zhì)⑷溫度（對(duì)分配影響大，對(duì)吸附影響?。烧归_(kāi)室內(nèi)展開(kāi)劑蒸氣飽和程度影響比移值的因素2）相對(duì)比移值Rst定性與對(duì)照品Rst比較或與文獻(xiàn)Rst比較。當(dāng)前39頁(yè)，總共51頁(yè)。2.雜質(zhì)檢查1）雜質(zhì)對(duì)照品比較法：同一色譜條件下比較試樣與雜質(zhì)對(duì)照品斑點(diǎn)的顏色深淺2）主成分自身對(duì)照法

供試品

稀釋對(duì)照液→對(duì)照斑點(diǎn)顏色

硫酸長(zhǎng)春堿稀釋對(duì)照液→展開(kāi)→紫外檢測(cè)10mg/ml0.20mg/ml254nm當(dāng)前40頁(yè)，總共51頁(yè)。3.定量分析1）洗脫法定量：薄層分離——取下斑點(diǎn)——洗脫——離心——取上清液進(jìn)行測(cè)定2）原位直接定量——薄層掃描法

當(dāng)前41頁(yè)，總共51頁(yè)。1）薄層掃描法原理----樣品經(jīng)TLC分離,按光學(xué)原理(吸收光、反射光、熒光等）進(jìn)行定量分析檢測(cè)原理熒光法透射法反射法反射法測(cè)定：重現(xiàn)性好，基線穩(wěn)定。薄層掃描法定義：用一定波長(zhǎng)、強(qiáng)度的光束照射薄層上的斑點(diǎn)，測(cè)量照射前后光束強(qiáng)度的變化來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量當(dāng)前42頁(yè)，總共51頁(yè)。2）光譜掃描曲線：A-或F-ex-em用途：對(duì)斑點(diǎn)成分作定性分析為定量分析找出測(cè)量sSA當(dāng)前43頁(yè)，總共51頁(yè)。3）色譜掃描曲線在一定的波長(zhǎng)下，可找出斑點(diǎn)的位置，即A-L(Rf)的關(guān)系起始線LA（1）單波長(zhǎng)（s）掃描法（2）雙波長(zhǎng)（R，

s）掃描法：得△A，可消除本底干擾，基線穩(wěn)定4）掃描方式：直線式：快。用于規(guī)則的圓斑鋸齒式：慢。用于不規(guī)則的或規(guī)則的斑點(diǎn)定量定性分析及熒光定量分析一律用直線式測(cè)定波長(zhǎng)λs及參比波長(zhǎng)λR的選擇λs：被測(cè)組分的最大吸收波長(zhǎng)λR：不被被測(cè)組分所吸收的波長(zhǎng)—薄層板的空白吸收當(dāng)前44頁(yè)，總共51頁(yè)。練習(xí)例1.硅膠柱分離羧酸，哪種溶劑tR最?。ǎ〢.苯B.乙酸乙酯C.乙醇D.丙酮E.丙醇例2.硅膠板以丙酮為展開(kāi)劑，下列化合物中哪種Rf最大（）；哪種Rf最小（）A.芳烴B.羧酸C.酯D.胺E.酮答案：CAB當(dāng)前45頁(yè)，總共51頁(yè)。例3.正相液液色譜柱上分離一極性化合物，哪種溶劑使其tR最小（）A.苯B.石油醚C.乙醇D.甲醇E.丙醇例6.反相液液色譜柱上分離一非極性化合物，哪種溶劑使其tR最?。ǎ〢