第三章 高效液相色譜分析

第三章高效液相色譜分析2023/3/29第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-1高效液相色譜法的特點(diǎn)

高效液相色譜法：一種用液體為流動(dòng)相的色譜分離分析方法。它在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入氣相色譜的理論，技術(shù)上采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器。第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日1.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較

高壓：HPLC采用高壓輸液設(shè)備,150-350*105Pa高速：HPLC流速大增，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需數(shù)小時(shí)。

高效：化學(xué)鍵和固定相,>30000塔板/米

高靈敏：10-9g（紫外檢測）、10-11g（熒光檢測）第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日2、HPLC與GC的區(qū)別分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量、熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，和組分之間沒有相互的作用力；HPLC采用的流動(dòng)相為各種極性不同的液體或液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動(dòng)相對分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-2高效液相色譜法理論基礎(chǔ)速率理論P(yáng)69

=2ldp+CdDmu+CmdP2CSmdP2Csdf2DmDmDs++uH=A++CuBu由于柱內(nèi)色譜峰擴(kuò)展所引起的塔板高度的變化為：第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日速率方程：

H=A+B/u+Cu（1）液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，HPLC中速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，（2）影響柱效的主要因素是傳質(zhì)項(xiàng)。第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日2、提高柱效的途徑：提高柱內(nèi)填料均勻性，減小固定相粒度（選擇薄殼形擔(dān)體）選用低粘度的流動(dòng)相或適當(dāng)提高柱溫，降低流動(dòng)相粘度;減小粒度是最有效的途徑.第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-3高效液相色譜法主要類型及分離原理1、液液分配色譜法2、液固吸附色譜法3、離子交換色譜法4、離子對色譜5、空間排阻色譜法

第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日1、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相）。固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。

反相色譜：固定相：C-18柱流動(dòng)相：甲醇第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日2、液-固吸附色譜

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣

缺點(diǎn)：非線性等溫吸附常引起峰的拖尾；第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日3、離子對色譜（分離有機(jī)酸、有機(jī)堿）

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜：固定相：非極性的疏水鍵和相(C-18柱)流動(dòng)相：含有對離子的甲醇-水或乙腈-水第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日4、離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的離子交換反應(yīng)；不同組分與離子交換劑之間親和力的大小不同。應(yīng)用：可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日5、空間排阻色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以進(jìn)入到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-4液相色譜固定相

1.液-液分配及離子對分離固定相

（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳。現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒

（2）表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量低；需要高靈敏度的檢測器。現(xiàn)在5~10μm全多孔型擔(dān)體使用廣泛第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日化學(xué)鍵合固定相

定義：用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)物分子結(jié)合到擔(dān)體表面。（目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相）

制備方法：

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅碳鍵型：≡Si—C

c.硅氮鍵型：≡Si—N

d.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）表面無液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）無固定液流失，增加了色譜柱穩(wěn)定性和壽命（3）可鍵合不同官能團(tuán)，選擇性好（4）有利于梯度洗脫；第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.液-固吸附色譜固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；目前，5～10μm硅膠微粒（全多孔型）使用最廣

第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相鍵合薄殼型；鍵合微粒擔(dān)體型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日4.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-5液相色譜的流動(dòng)相

1.流動(dòng)相特性

液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相對組分有親和力，流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況

第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）溶劑粘度小些（5）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.流動(dòng)相選擇在選擇流動(dòng)相時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。例：采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-6

高效液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日液相色譜儀（1）第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日液相色譜儀（2）第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.主要部件(1)高壓泵為了獲得高柱效，HPLC使用粒度很小的固定相（<10μm），液體流經(jīng)色譜柱受到的阻力大應(yīng)具有流量穩(wěn)定、壓力平穩(wěn)無脈動(dòng)等特性。分為恒流泵、恒壓泵，各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵逐漸取代恒壓泵。第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日(2)梯度洗提裝置（P84）梯度洗提：流動(dòng)相中含有兩種或以上不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相的組成來改善和提高分離效果。與氣相色譜中程序升溫的區(qū)別：（GC）程序升溫通過改變柱溫來達(dá)到改善分離（HPLC）梯度洗提通過改變流動(dòng)相的組成來改善分離第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日(3)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用六通閥，第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日(4)色譜柱

柱體為直型不銹鋼管，標(biāo)準(zhǔn)柱子的內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，柱長15～30cm，填料一般5~10m。發(fā)展趨勢是減小填料粒度以提高柱效和減小柱徑第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日(5)檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，適用對紫外有吸收的物質(zhì)，

特點(diǎn)：通用性較好，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)；靈敏度較高；檢測器對流動(dòng)相的溫度變化和流速不敏感（梯度洗提）；

第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日光電二極管陣列檢測器（PAD、DAD）紫外檢測器的重要進(jìn)展；采用2048個(gè)二極管或更多組成陣列，得到三維色譜-光譜圖。

優(yōu)點(diǎn):

(1)可獲得組分的全部光譜信息，很快定性鑒定組分；

(2)可判斷組分純度。第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日b.熒光檢測器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；利用試樣具有熒光特性對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；

第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日c.示差折光檢測器（通用型檢測器）

（differentialrefractiveindexdetector）

可連續(xù)檢測參比池和樣品池中溶液之間的折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比。

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；缺點(diǎn)：對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；

第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-7分離類型選擇

choiceofseparationtypes第三十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日§3-8HPLC的應(yīng)用

applicationofHPLC

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：示差折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。第三十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇