基因工程克隆載體

基因工程克隆載體第1頁/共32頁2噬菌體的溶原性周期和溶菌性周期天然的轉(zhuǎn)基因過程2/31第2頁/共32頁31.λ噬菌體克隆載體λ噬菌體（Bacteriophagelambda）頭部尾部尾絲3/31第3頁/共32頁4（1）λDNA：線狀，雙鏈DNA，48502bp（linear，double-strandedDNA，dsDNA）cos位點(diǎn)：λDNA兩端各有12bp的粘性末端，兩者互補(bǔ)，進(jìn)入宿主后可連成環(huán)狀DNA。1.1、λ噬菌體的性質(zhì)4/31第4頁/共32頁5宿主細(xì)胞頭部尾部尾絲λDNA5/31第5頁/共32頁66/31第6頁/共32頁7（2）λDNA有56個(gè)限制酶識(shí)別序列，50個(gè)基因，左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。Cos頭部合成尾部合成刪除與結(jié)合重組DNA合成晚期控制阻遏阻遏早期控制溶菌成熟左臂leftarm右臂rightarm中央片段centralstuffer7/31第7頁/共32頁8(3)、λ噬菌體的侵染8/31第8頁/共32頁91.2、λ噬菌體載體的構(gòu)建（1）切去λDNA的中央片段BamHIsitesLeftarmRightarmCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收9/31第9頁/共32頁10（2）插入標(biāo)記基因（markergene）例如：lacZ基因，轉(zhuǎn)化的菌斑在含有X-gal的培養(yǎng)基因上表現(xiàn)籃色.10/31第10頁/共32頁11（3）插入外源基因（foreigngene）可插入20kb的目的基因。11/31第11頁/共32頁12部分消化DNAligase基因組DNACOSCOSLRAimgeneLRAimgeneCOS12/3120kb的DNA片段第12頁/共32頁13（4）建立λDNA體外包裝系統(tǒng)（packingsystem）包裝后方可侵染.13/31第13頁/共32頁14重組的噬菌體體外包裝14/31第14頁/共32頁152、柯斯質(zhì)粒載體（Cosmidvector）2.1含義：含有λ噬菌體粘性末端（cos位點(diǎn)）的質(zhì)粒，又稱粘粒2.2特點(diǎn)：帶有cos位點(diǎn)4-6kb有標(biāo)記基因常用于構(gòu)建cDNA文庫（cDNAlibrary）可攜帶大的基因片段，45kb。2.3構(gòu)建過程15/31第15頁/共32頁16體外包裝16/31第16頁/共32頁17第三節(jié)、染色體定位整合載體基因整合平臺(tái)系統(tǒng)：包括整合平臺(tái)和定位整合克隆載體。整合平臺(tái)：受體細(xì)胞基因組上給定的一個(gè)DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置。定位整合克隆載體：質(zhì)粒克隆載體，有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺(tái)DNA區(qū)域同源的DNA片段。17/31第17頁/共32頁18一、定位整合模式ForeignDNAHomologoussequenceVectorDNAGenomeDNAofreceptorcellGenomeDNAofreceptorcellHomologoussequenceVectorDNA18/31第18頁/共32頁19與受體細(xì)胞和同源序列長(zhǎng)短有關(guān)，一般較低(10-7-10-3).會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)插入，篩選困難。二、定位整合效率19/31第19頁/共32頁201定義酵母人工染色體：具有酵母染色體的著絲粒（cen4）、自主復(fù)制序列(ARS1)和端粒等功能序列的質(zhì)粒載體。可容納1000至3000kb的DNA大片段。第四節(jié)YAC克隆載體20/31第20頁/共32頁21是Yeast和E.coli.的穿梭載體(shuttlevector)YAC在E.coli.中按質(zhì)粒形式復(fù)制，轉(zhuǎn)入酵母菌后按染色體形式復(fù)制。穿梭載體:含有不止一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)、能攜帶插入序列在不同種類宿主細(xì)胞中繁殖的載體21/31第21頁/共32頁22著絲粒端粒自主復(fù)制序列22/31端粒E.coli.originofreplicationmarkergenesinyeastmarkergenesInE.coli.markergenesinyeast第22頁/共32頁23外源基因EcoRI23/31YAC克隆載體的構(gòu)建第23頁/共32頁242應(yīng)用2.1構(gòu)建基因組文庫（genomelibrary）：特別適于動(dòng)植物等基因組較大的生物。2.2、基因治療(Genetherapy)：可復(fù)制，安全24/31第24頁/共32頁25一、啟動(dòng)子探針型載體質(zhì)粒載體，含有一個(gè)檢測(cè)部件（一個(gè)無轉(zhuǎn)錄功能的標(biāo)記基因和克隆位點(diǎn)）第五節(jié)、特殊用途的載體25/31第25頁/共32頁26ThegenewhichcannotexpressGFPgeneMultiplecloningsitesAMPr26/31第26頁/共32頁27二、誘導(dǎo)型表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性。外源基因處于這樣的啟動(dòng)子下，必須有誘導(dǎo)條件才能表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：易于人的控制，安全，可用于基因治療。27/31第27頁/共32頁28三、組織特異性表達(dá)載體只能在特定組織中表達(dá)的載體。乳腺組織特異性表達(dá)載體：利用牛、羊等動(dòng)物的乳腺產(chǎn)生藥物。腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)載體：基因治療藥物的定向?qū)搿?8/31第28頁/共32頁29四、分泌型表達(dá)載體基因表達(dá)的蛋白可分泌到胞外，利于產(chǎn)物分離純化。29/31第29頁/共32頁30本章主要內(nèi)容小結(jié)：常用質(zhì)粒載體、Ti質(zhì)粒載體。病毒載體染色體定位整合載體酵母人工染色體載體特殊用途的克隆載體上述載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及構(gòu)建方法及原理。課后到“生物工程學(xué)院網(wǎng)站主頁”中精品課程中的基因工程原