新生兒耳聾基因的檢測研究,耳鼻咽喉科論文

新生兒耳聾基因的檢測研究,耳鼻咽喉科論文上世紀(jì)80年代，北京、上海、廣州率先開展新生兒兩病篩查〔先天性甲狀腺功能減低癥和苯丙酮尿癥〕，后逐步推廣到全國各地，新生兒疾病篩查逐步成為出生缺陷三級預(yù)防的重要手段。隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，診療技術(shù)的提高，篩查的病種越來越多，醫(yī)務(wù)人員對新生兒耳聾基因檢測的認(rèn)識也在逐步提高。我院在家長知情同意的情況下對2020-01-2021-03出生的9421例新生兒進(jìn)行耳聾基因檢測，現(xiàn)報告如下。1資料與方式方法1.1臨床資料2020-01-2021-03在石家莊市婦幼保健院出生的9421例新生兒，華而不實男1例，女4528例。1.2方式方法新生兒出生3d后采足跟血3滴，滴到專用濾紙片上自然晾干，每個血斑直徑不得小于8mm.檢測位點：所有新生兒均檢測GJB2基因2位點〔235delC和299-300delAT〕、SLC26A4基因2位點〔IVS7-2AG和2168AG〕和線粒體12SrRNA基因2位點〔1555AG和1494CT〕?；蚪MDNA的提?。孩俅秊V紙片上血滴晾干后，用打孔鉗打下3mm血片放入1.5ml無菌離心管中。②離心管中參加500l滅菌雙蒸水，振蕩混勻后靜置5min,12000r/min離心1min.③吸棄上清，重復(fù)操作②1次。④吸棄上清，參加DNA提取液200l,100℃水浴8min.⑤12000r/min離心5min,上清為DNA擴增模板。1.3熒光PCR基因檢測應(yīng)用濟南英盛先天性耳聾基因檢測試劑盒、遲發(fā)性耳聾基因檢測試劑盒和藥物性耳聾基因檢測試劑盒，每個反響孔參加23l相應(yīng)檢測位點反響液，2l上述DNA擴增模板，于ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行反響。反響條件：50℃2min,95℃2min,40循環(huán)95℃10s~61℃33s.1.4結(jié)果判讀根據(jù)試驗調(diào)節(jié)基線和閾值，Ct值35視為有效擴增，在這里基礎(chǔ)上觀察實時熒光曲線判讀結(jié)果：FAM通道曲線呈S型增長判為野生型，HEX通道曲線呈S型增長判為純合突變型，2條曲線同時呈S型增長判為雜合突變型，2條曲線同時不增長視為無效樣本。2結(jié)果9421例新生兒發(fā)現(xiàn)突變攜帶者384例〔男205例，女179例〕，6位點攜帶率為4.08%.華而不實158例〔1.68%〕攜帶235delC雜合突變，1例〔0.01%〕攜帶235delC純合突變，55例〔0.58%〕攜帶299-300delAT雜合突變；133例〔1.41%〕攜帶IVS7-2AG雜合突變，1例〔0.01%〕攜帶IVS7-2AG純合突變，19例〔0.20%〕攜帶2168AG雜合突變；14例〔0.15%〕攜帶1555AG均質(zhì)突變，3例〔0.03%〕攜帶1555AG異質(zhì)突變。華而不實1例〔0.01%〕同時攜帶有235delC雜合突變，IVS7-2AG雜合突變和1555AG異質(zhì)突變，1例〔0.01%〕同時攜帶有235delC雜合突變，IVS7-2AG雜合突變。本研究中235delC位點雜合突變的新生兒中有1例右耳中耳炎伴有腭裂且右耳聽力篩查未通過，經(jīng)治療康復(fù)后于3月齡時進(jìn)行聽力診斷為單側(cè)中度耳聾；1例攜帶有235delC純合突變的新生兒左耳未通過聽力篩查；1例攜帶有IVS7-2AG純合突變的新生兒未通過聽力篩查，于3月齡時進(jìn)行聽力診斷，CT結(jié)果示右耳前庭水管擴張，耳蝸發(fā)育不全；1例同時攜帶有235delC雜合突變、IVS7-2AG雜合突變和1555AG異質(zhì)突變的新生兒和1例同時攜帶有235delC雜合突變、IVS7-2AG雜合突變的新生兒均通過了聽力篩查，并于6月齡回訪時聽力正常。見表1.耳聾基因突變者不管雜合突變還是純合突變?nèi)窟M(jìn)行Sanger法基因測序驗證，結(jié)果全部符合，部分測序圖譜見圖1.各突變位點占突變總數(shù)比例見表2.石家莊市耳聾基因熱門位點突變率情況與周怡等〔1〕報道的北京市15343例耳聾基因突變率比擬，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.01〕.3討論3.1石家莊市新生兒耳聾基因檢測的必要性9421例新生兒血片樣本檢出耳聾基因突變者384例，六位點攜帶率為4.08%,華而不實GJB2基因雜合或純合突變214例〔攜帶率為2.27%〕,SLC26A4基因雜合或純合突變153例〔攜帶率1.62%〕，線粒體12SrRNA基因均質(zhì)或異質(zhì)突變17例〔攜帶率0.18%〕。與周怡等〔1〕報道的北京市數(shù)據(jù)比擬，發(fā)現(xiàn)石家莊市GJB2基因和SLC26A4基因的突變攜帶率高于北京市，mtDNA12SrRNA基因低于北京市；GJB2基因235delC位點、GJB2基因299-300delAT位點和SLC26A4基因IVS7-2AG位點依次高出北京市0.39%、0.18%和0.42%,SLC26A4基因2168AG位點和mtD-NA12SrRNA基因1494CT位點的突變率與北京市持平，mtDNA12SrRNA基因1555AT位點的突變率低于北京市0.12%,講明耳聾基因突變攜帶率存在地區(qū)差異，本研究數(shù)據(jù)可為當(dāng)?shù)嘏R床診療及相關(guān)部門制定政策提供根據(jù)，當(dāng)兒童聽力篩查未通過時應(yīng)考慮能否為基因突變所致，臨床檢測中可優(yōu)先檢測突變率高的位點，以提高檢出率并根據(jù)檢測結(jié)果有針對性地進(jìn)行干涉和治療。有文獻(xiàn)報道，先天性耳聾在新生兒期的發(fā)病率為0.1%~0.186%〔2〕,華而不實約60%是由遺傳因素導(dǎo)致的〔3〕,所以在新生兒人群中開展耳聾基因熱門位點檢測非常有必要。3.2特殊病例隨訪情況本次篩查發(fā)現(xiàn)的5例特殊患者中有2例通過，家長反映新生兒對聲音反響良好，這2例分別是不同基因的雙雜合突變和多雜合突變，講明不同基因的不同位點突變之間不會產(chǎn)生累加效應(yīng)。另一種情況是新生兒可能是遲發(fā)性或漸進(jìn)性聽力損失，家長自以為新生兒聽力正常。建議家長應(yīng)有足夠的重視，定期檢測新生兒聽力情況，以免影響新生兒的語言發(fā)育。3例未通過聽力篩查的患者中，1例IVS7-2AG純合突變攜帶者確診大前庭導(dǎo)水管綜合征、耳蝸發(fā)育不全、重度耳聾，已佩戴助聽器。該新生兒父母均為IVS7-2AG雜合突變攜帶者，因而再次妊娠時應(yīng)行產(chǎn)前耳聾基因診斷，以避免耳聾患兒的出生。1例235delC雜合突變攜帶者右耳中耳炎、右耳聽力篩查未通過且伴有腭裂，經(jīng)治療康復(fù)后于3月齡聽力診斷為單側(cè)中度耳聾，有研究表示清楚GJB2基因的純合突變與雜合突變聽力損失程度有差異不同〔4〕,因而揣測235delC雜合突變是其聽力損失的原因，也不排除該新生兒在GJB2基因存在其他沒有能檢測到的位點突變構(gòu)成復(fù)合雜合突變導(dǎo)致聽力下降的可能。1例235delC純合突變攜帶者出生3d時行聽力篩查初篩，左耳未通過，生后42d將來復(fù)查，之后屢次隨訪家長仍反映對聲音反響良好。有文獻(xiàn)報道，GJB2相關(guān)性耳聾在聽力損失程度、始發(fā)年齡、兩側(cè)對稱性、穩(wěn)定性方面都具有多態(tài)性，一般為雙耳同時受累，耳聾程度呈對稱性，少數(shù)表現(xiàn)為不對稱性，也有單耳受損的報道〔5〕.GJB2基因突變所致聽力損害有的比擬穩(wěn)定，長期維持在一定的聽力水平，有的表現(xiàn)為短期內(nèi)急劇下降，有的表現(xiàn)為緩慢漸進(jìn)性下降，或呈波動性下降〔6-7〕,也有可能單側(cè)聽力損失不易引起家長注意，所以該新生兒家長需提高警覺，定期檢測新生兒聽力。3.3各突變位點占突變總數(shù)的比例六位點突變率順位排序依次為：GJB2235delC、SLC26A4IVS7-2AG、GJB2299-300delAT、SLC26A42168AG、mtDNA12SrRNA1555AG、mtDNA12SrRNA1494CT,所以GJB2235delC和SLC26A4IVS7-2AG成為石家莊市新生兒的熱門突變位點。固然當(dāng)前耳聾基因檢測成本較高，但是人們應(yīng)重視其檢測的重要性，本研究可以為當(dāng)?shù)馗骷壊块T制定出生缺陷相關(guān)政策提供數(shù)據(jù)參考。綜上所述，開展新生兒耳聾基因檢測意義重大，遺傳性耳聾的遺傳方式多為常染色體隱性遺傳或母系遺傳，因而將耳聾基因檢測納入到婚檢、孕產(chǎn)前檢測中，對夫婦雙方進(jìn)行耳聾基因檢測，將會更大程度降低生育聾兒的風(fēng)險，這樣能夠把新生兒耳聾的三級預(yù)防提早到一、二級預(yù)防當(dāng)中。因而各級應(yīng)加大宣傳力度，使得耳聾基因檢測在三級預(yù)防中能夠發(fā)揮更大作用。以下為參考文獻(xiàn)[1]周怡，劉海紅，郝津生，等.15343例新生兒新生兒耳聾基因普遍篩查結(jié)果分析[J].中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2020,12〔2〕:109-112.[2]李倩.新生兒聾病易感基因篩查的研究進(jìn)展[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2021,23〔1〕:91-96.[3]朱曉燕，魏欽俊，魯雅潔，等.耳聾分子病因?qū)W檢測與臨床應(yīng)用研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報〔自然科學(xué)版〕，2020,33〔2〕:186-190.[4]CRYNSK,ORZANE,MURGIAA,etal.Ageno-type-phenotypecorrelationforGJB2〔connexin26〕deafness[J].JMedGenet,2004,41:147-154.[5]歐陽治國，吳皓.GJB2基因突變及其聽力損失特點[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2008,16〔1〕:72-74.[6