分子生物學(xué)實驗技術(shù)課件

分子生物學(xué)實驗技術(shù)一、基因克隆技術(shù)目的基因和載體限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化抗性篩選獲得基因序列：通過RT-PCR或基因組數(shù)據(jù)庫獲得引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增目的片段PCR產(chǎn)物連接到載體上構(gòu)建成重組載體重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增或表達(dá)蛋白抗性篩選基因克隆實驗的一般過程非定向克隆+或克隆的片段只能按特定方向連接定向克隆+EcoRI+HindIII切EcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIAAEcoRI+HindIII切PCR擴(kuò)增EcoRIHindIII基因組DNA文庫的構(gòu)建基因組DNA文庫的類型質(zhì)粒文庫（﹤10kb)噬菌體文庫（0-23kb)黏粒文庫(~45kb)酵母人工染色體文庫(又稱大片段基因組DNA文庫，100kb—1Mb）基因組DNA文庫的構(gòu)建流程插cDNA文庫的構(gòu)建（三）PCR衍生技術(shù)PCR過程反轉(zhuǎn)錄PCR實時熒光定量PCR

PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為

CT

值（thresholdvalue）。1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲線分析

2、TaqMan探針法

原位PCR技術(shù)原理由于細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)PCR擴(kuò)增時，各種成分（如如引物、DNA聚合酶、核苷酸等）均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，與原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大、或互相交織，不易穿過細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)級擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就可以被原位雜交技術(shù)檢測出來。

重疊延伸PCR技術(shù)由于使用了具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來?？珊唵窝杆俚膶蓚€DNA片段連在一起，用于嵌合基因的構(gòu)建重疊延伸PCR原理三、DNA-蛋白互作技術(shù)過濾結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀法凝膠阻滯分析DNA酶足跡DNase足跡法，DMS足跡法酵母單雜交將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動的上游，把報告基因連接到啟動子下游，將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能與順式作用元件結(jié)合，就能激活啟動子使報告基因得到表達(dá)。DNaseI足跡蛋白質(zhì)與DNA特定區(qū)段相結(jié)合，從而使該區(qū)段DNA免受DNase的降解，在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記條帶。染色質(zhì)免疫共沉淀（ChiP）在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。四、蛋白組學(xué)研究蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)相互作用的研究方法：酵母雙雜交技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)，表面等離子共振技術(shù)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)，免疫共沉淀技術(shù)，pull-down技術(shù)蛋白質(zhì)分離最常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)明的雙向電泳（2-DE），是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同在pH梯度介質(zhì)中進(jìn)行第一次分離，即等點聚焦（IEF)，然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同進(jìn)行第二次分離，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳之后，用蛋白質(zhì)水解酶裂解成肽段，可用于質(zhì)譜分析。通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值（M/Z值）的蛋白離子分離開，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。兩種離子發(fā)生方法：基質(zhì)輔助激光解吸附/離子化（MALDI)、電噴霧離子化（ESI)噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是將編碼目的蛋白的基因與編碼噬菌體表面蛋白的基因融合后，以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面的一種技術(shù)。將不同蛋白的cDNA插入噬菌體載體進(jìn)行表達(dá)，得到表達(dá)不同蛋白的一定規(guī)模的噬菌體展示庫。將“誘餌”蛋白固定化，基于“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白之間的相互作用，可將展示庫中與固定化的“誘餌”蛋白有相互作用的“獵物”蛋白分離純化出來，再對“獵物”蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。表面等離子共振技術(shù)（SPR）SPR是利用單色偏振光與金屬膜內(nèi)表面店子發(fā)生的等離子共振時，SPR角（反射光強度最小時的入射角）與金屬表面結(jié)合的生物分子的質(zhì)量呈正比，如將“誘餌”蛋白座位配基，固化在幾十納米的金屬膜表面，加入“獵物”蛋白溶液，這樣就可以通過SPR角的改變來反映“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物從而反映二者的相互作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。

作為規(guī)模化功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，是DNA芯片技術(shù)的擴(kuò)展，即在固體支持物表面高密度地固定化排列探針蛋白點陣，以特異地捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測器對靶蛋白進(jìn)行定性或定量分析。Proteinmicroarray（蛋白質(zhì)芯片）免疫共沉淀技術(shù)當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用被保留下來，如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉淀復(fù)合物被分開，然后用免疫印記或質(zhì)譜檢測目的蛋白。Pull-d