郜剛分子生物學(xué)-10-4-基因克隆技術(shù)

本節(jié)點(diǎn)了解5.4基因克隆的概念5.4.1RACE5.4.2RDA5.4.3Gateway大規(guī)模克隆5.4.4Map-basedcloning5.4.5tail-PCR5.1.1克隆與克隆熱克隆的現(xiàn)代含義基因克隆基因克隆策略基因克隆相關(guān)技術(shù)SeverinoAntinori

PanosZavos

塞維里諾·安蒂諾里帕納奧斯·扎沃斯意大利男性不育癥專家美國(guó)肯塔基大學(xué)生殖生理學(xué)家

2001年3月1997年2月，英國(guó)羅斯林研究所wilmut等（見Nature

385,810–813;1997）克隆的第一次發(fā)熱實(shí)際上是在1997年克隆羊Dolly(1997-2003)2001年1月2000年8月克隆鼠、克隆牛、克隆豬等相繼問世含有黃色熒光基因（水母）的克隆小豬美國(guó)密蘇里大學(xué)2001年10月顏色美國(guó)邪教組織

“雷利安運(yùn)動(dòng)”

鐵了心的要克隆人

左圖為冒死也要克隆人布瓦瑟利耶

2001年7月2000年9月克隆技術(shù)伊拉克總統(tǒng)薩達(dá)姆

準(zhǔn)備克隆100個(gè)小薩達(dá)姆狂人政客

美國(guó)先進(jìn)細(xì)胞科技公司

（AdvancedCellTechnology

Ltd）

2001年11月25日世界首例人類克隆胚胎該公司發(fā)言人韋斯特

克隆技術(shù)美國(guó)馬薩諸塞州的生物技術(shù)公司主流科學(xué)家的偽科學(xué)(1)：韓國(guó)“克隆之父”黃禹錫教授的造假2005年刊載于《科學(xué)》雜志上的黃禹錫（韓國(guó)首爾大學(xué)）論文數(shù)據(jù)屬于故意偽造：沒有證據(jù)表明黃禹錫曾利用患者體細(xì)胞克隆出任何胚胎干細(xì)胞，論文數(shù)據(jù)屬于故意偽造，克隆的11個(gè)干細(xì)胞至少有9個(gè)是偽造的，另外兩個(gè)也和病人細(xì)胞不匹配浙江大學(xué)論文造假風(fēng)波……中國(guó)工程院院士李連達(dá)博士后賀海波踏實(shí)為學(xué)誠(chéng)信為人堅(jiān)守道德守住底線

Dolly克隆技術(shù)克隆技術(shù)Clone翻譯過(guò)來(lái)克隆“Clone”起源于希臘文“Klone”，原意：用“嫩枝”或“插條”繁殖。最初意義無(wú)性繁殖現(xiàn)代意義

兩個(gè)詞性、三層含義動(dòng)詞，通過(guò)某種操作比如顯微操作、分子生物學(xué)操作來(lái)獲得與某種祖先相同的分子、細(xì)胞、個(gè)體的過(guò)程。名詞，通過(guò)上述操作獲得的遺傳上與祖先相同的分子、細(xì)胞、個(gè)體。克隆技術(shù)媒體意義抄襲作弊造假

當(dāng)作名詞時(shí)，克隆是指由遺傳組成完全相同的分子、細(xì)胞或個(gè)體組成的一個(gè)群體。例如，

DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷貝；細(xì)胞克隆則是來(lái)源于同一祖細(xì)胞的、基因型完全相同的一群子細(xì)胞；個(gè)體克隆則是指基因型相同的個(gè)體的拷貝。

克隆技術(shù)

當(dāng)作動(dòng)詞是指運(yùn)用DNA重組技術(shù)將一個(gè)特定的基因或DNA序列輸入一個(gè)載體分子；也指分離出單個(gè)分子、基因、細(xì)胞或個(gè)體后，使之增殖成一個(gè)群體的一系列實(shí)驗(yàn)操作?？寺〖夹g(shù)分子生物學(xué)中特指基因克?。╣enecloning）

指的是從基因組中把某個(gè)基因分離出來(lái)，再把它重組在合適的載體上，使之增殖成許多拷貝的過(guò)程。

1、基因的序列如何；2、染色體上，位置關(guān)系如何；3、放置在合適的載體上?？寺〖夹g(shù)

基因克隆的一般策略已知基因的序列已知基因的DNA全部或部分DNA序列（功能可能已知）已知其它物種的同類基因的DNA序列（功能可能已知）已知目的基因cDNA全部或部分序列已知目的基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白等序列一般采用PCR技術(shù)或探針分子雜交技術(shù)已有基因圖位或標(biāo)記、轉(zhuǎn)座子等未知基因的序列用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、T-DNA標(biāo)簽法及圖位克隆技術(shù)隨機(jī)引物多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)，定向引物擴(kuò)增技術(shù)和DDRT-PCR、SSH-PCR、RAP-PCR、DNA-RDA、cDNA捕捉法差異篩選法、差減雜交（SH）、mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）、代表性差異分析（RAD）、抑制型差減雜交（SSH）有差異表達(dá)的目的基因無(wú)差異表達(dá)的目的基因目的基因表達(dá)具有組織、器官等時(shí)空差異性文庫(kù)篩選法、功能蛋白分離法即直接測(cè)序等進(jìn)行，是難度較大較繁瑣的策略表型克隆策略目的基因定位克隆策略反向遺傳學(xué)侯選定位克隆策略功能克隆策略Newtechnology???1已知序列基因的克隆概述：對(duì)已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡(jiǎn)便的一種。獲取基因序列多從文獻(xiàn)中查取,即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)?，F(xiàn)在國(guó)際上公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個(gè)基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫(kù)中注冊(cè),擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)(accession

number),以便別人參考和查詢補(bǔ)充：已知序列克隆1/4已知序列的來(lái)源目前,世界上主要的基因庫(kù)有: (1)EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫(kù),其網(wǎng)上地址為http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,為設(shè)在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫(kù),其網(wǎng)上地址為http://www.ncbi./web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL, Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫(kù),其所含序列的準(zhǔn)確度比較高,而TREMBL只含有從EMBL庫(kù)中翻譯過(guò)來(lái)的序列。補(bǔ)充：已知序列克隆2/4目前,以Genbank的應(yīng)用最頻繁。免費(fèi)查詢基因序列設(shè)計(jì)特異的引物,通過(guò)PCR從基因組中克隆該基因，也可以通過(guò)RT-PCR克隆cDNA。補(bǔ)充：已知序列克隆3/4

這是基因克隆的一種較直接的方法。

值得注意的是,由于物種和分離株之間的差異,為了保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性,有必要采用兩步擴(kuò)增法,即nestedPCR。補(bǔ)充：已知序列克隆4/42表型或功能克?。私猓?、定義表型克?。╬henotypiccloning）或者稱為功能克隆（functionalcloning）、差異基因克隆。從功能出發(fā)，利用特定組織細(xì)胞器官與正常組織細(xì)胞器官DNA或RNA水平上的差異，進(jìn)行相關(guān)基因的分離與克隆，這些基因表達(dá)變化是與可檢測(cè)的表型變化直接聯(lián)系的，故稱為表型克隆，這些表型變化又是與某種生理功能緊密相關(guān)的，所以又稱為功能克隆。補(bǔ)充：功能克隆1/4抗病與不抗病的表型產(chǎn)物已知基因的功能克隆方法

（適用于產(chǎn)物和功能已知的基因）具體作法在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù),DNA文庫(kù)中基因的篩選根據(jù)情況主要可用二種辦法進(jìn)行

(1)將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測(cè)序,據(jù)此合成寡核苷酸探針從cDNA庫(kù)或基因組文庫(kù)中篩選編碼基因,(2)將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)抗體探針,從cDNA入載體表達(dá)庫(kù)中篩選相應(yīng)克隆。 功能克隆是一種經(jīng)典的基因克隆策略,很多基因的分離利用這種策略?？寺〖夹g(shù)

功能克隆

氨基酸序列核苷酸序列PCR特異蛋白質(zhì)目的基因

抗體

基因文庫(kù)篩選尋找表型異常找出導(dǎo)致表型異常的異常功能蛋白質(zhì)根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)DNA序列以此為探針篩查基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù)克隆這種異常蛋白質(zhì)的編碼基因2/4補(bǔ)充：功能克隆2/4（了解）評(píng)價(jià)

優(yōu)點(diǎn)--

在單基因性狀的基因分離方面仍為常用策略

缺點(diǎn)--

特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難

--難以分離微量表達(dá)基因

--無(wú)法研究無(wú)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因

--難以進(jìn)行多基因控制性狀的基因分離

3/4補(bǔ)充：功能克隆3/4（了解）產(chǎn)物序列未知基因的功能克隆方法（適用于功能已知、產(chǎn)物未知的基因）mRNA差異展示（mRNAdifferentialdisplay,DDRT-PCR）代表性差示分析（representationaldifferenceanalysis,RDA）抑制性差減雜交（suppressionsubtractivehybridization,SSH）差異消減展示（differentialsubtractiondisplay,DSD）補(bǔ)充：功能克隆4/4page1845.4.1RACE技術(shù)

(rapid-amplificationof

cDNAends)5’RACE3’RACEclassicRACETheSMARTRACE:SwitchingMechanismAt5'endofRNATranscript.

TheTakalaRACEp183RACE重點(diǎn)了解其原理了解其主要的操作步驟RACE

(rapid-amplificationof

cDNAends)是Frohman等

20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的cDNA末端克隆技術(shù)。通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)。經(jīng)典的RACE主要通過(guò)RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列來(lái)得到完整的cDNA5′和3′端，包括單邊PCR和錨定PCR。完整的cDNA序列可以通過(guò)文庫(kù)的篩選和末端克隆技術(shù)獲得。RACE經(jīng)典的RACE特點(diǎn)：從一個(gè)相同的cDNA模板進(jìn)行5’和3’末端快速克隆的方法。首要條件：至少獲得mRNA的23－28個(gè)核苷酸序列信息，以此來(lái)設(shè)計(jì)5’末端和3’末端RACE反應(yīng)的基因特異性引物（genespecificprimer，GSP）步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、特異性差RACE克隆目標(biāo)cDNA全長(zhǎng)

3種情況，3種策略aaaaa5’aaaaa目標(biāo)A段已知或C段已知或B段已知策略13’RACE已知5’擴(kuò)3’5’策略25’RACE已知3’擴(kuò)5’策略35’RACE和3’RACERACE5’RACE(通常用于已知3’求5’)5’AAAAAAAA3’CCCCCC5’3’5’AAAAAAAA3’mRNAcDNA第一鏈GSP1→→GGGGaaaaaGSP2詳細(xì)文字見page191注意書中有錯(cuò)誤第2步應(yīng)該為RNaseH；第4步應(yīng)該是oligodG做錨定引物1利用已知基因片段，設(shè)計(jì)基因特異的引物GSP1，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA第一鏈；2用RNAaseH降解雜合鏈中的mRNA，3末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA3’端增加oligodC，4針對(duì)oligodC設(shè)計(jì)錨定引物AP，以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增出5‘端AP3’RACE(通常用于已知5’求3’)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTT5’5’AAAAAAAA3’mRNAcDNA第一鏈GSP1TTTTTTTT1利用已知基因片段3’末端的polyA，設(shè)計(jì)錨定引物oligodT（引物3‘端增加兩個(gè)兼并引物），在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA第一鏈；2用RNAaseH降解雜合鏈中的mRNA，3利用基因特異的引物GSP和錨定引物進(jìn)行PCRAPRACE方法的改進(jìn)對(duì)傳統(tǒng)RACE技術(shù)的改進(jìn)主要是引物設(shè)計(jì)及RT-PCR技術(shù)的改進(jìn)1、利用鎖定引物(lockdockingprimer)合成第一鏈cDNA，即在oligo(dT)引物的3’端引入兩個(gè)簡(jiǎn)并的核苷酸[5’-Oligo(dT)16-30MN-3’，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始點(diǎn)，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時(shí)oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結(jié)合所帶來(lái)的影響；補(bǔ)充：RACE（了解）2、在5’端加尾時(shí)，采用poly(C)，而不是poly(A)3、采用RNaseH-MMLV（莫洛尼氏鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶）或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫（60度-70度）有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA，從而消除了5’端由于高CC含量導(dǎo)致的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響4、采用熱啟動(dòng)PCR(hotstartPCR)技術(shù)和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反應(yīng)的特異性RACE方法的改進(jìn)補(bǔ)充：

RACE（了解）商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品CLONTECH的SMARTRACE技術(shù)TAKALA的fullRACE技術(shù)BioGene的CapFishingTM

技術(shù)補(bǔ)充：

RACE（了解）

SMART?RACEcDNAAmplificationKit

補(bǔ)充：

RACE（了解）補(bǔ)充：

RACE（了解）SMART?RACE技術(shù)smart在什么地方？不同反轉(zhuǎn)錄酶合成的cDNA3’端具有不同的保真度和不同的加尾特性，MMLV可以在cDNA末端特異地加上3-4個(gè)甚至更多個(gè)dCTP。SMART?RACE技術(shù)就是利用MMLV的這一特性合成cDNA第一鏈，同時(shí)利用它的加尾特性在合成的cDNA鏈3’加上3-4個(gè)dCTP，而且當(dāng)帽子結(jié)構(gòu)存在時(shí)該酶的加尾活性變得最高，這就起到了對(duì)全長(zhǎng)分子的富集的作用SwitchingMechanismAt5'endofRNATranscript.

補(bǔ)充：

RACE（了解）SMARTTM5’-RACE的原理是先是利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligo(dT)30MN作為鎖定引物。在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。利用該反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在第一鏈的5’末端自動(dòng)加上3-5個(gè)dC，退火后dC與含有Oliogo(dG)通用接頭引物配對(duì)后，第一鏈轉(zhuǎn)換為模板。接頭上帶有通用引物UPM(universalprimer,UPM)的結(jié)合位點(diǎn)，UPM作為上游引物，用一個(gè)基因特異引物2(genespecificprimer,GSP2)作為下游引物，擴(kuò)增出第二鏈補(bǔ)充：

SMARTRACE5’First-strandsynthesisisprimedusingamodifiedoligo(dT)primer.AfterreversetranscriptasereachestheendofthemRNAtemplate,itaddsseveraldCresidues.TheSMARTIIAOligonucleotideannealstothetailofthecDNAandservesasanextendedtemplateforPowerScriptRTpolymerase.MechanismofSMART?cDNAsynthesis（了解）補(bǔ)充：End-to-EndPCR

and

Ligationof5'-and3'-RACEFragments

End-to-EndPCR

Ifyouknowtheextremesequencesofthe5'-and3'-endsofyourtargetcDNA,youcanusethesequencestodesign5'and3'primersforthegenerationofyourtargetfull-lengthcDNA.Theextremesequencesofthe5'-and3'-endscanbeobtainedfromthe5'-and3'-RACEproductsofyourgenethatisgeneratedbythiskitasdescribedintheSections5and6.Ifyouknowthesequenceatthe5'and3'endsofatargetcDNA,youcansynthesize5'and3'primersandperformPCRusingthem.Ligationof5'-and3'-RACEFragments

IfyouknowauniquerestrictionenzymesiteinyourtargetcDNA,youcanusetherestrictionsitetogeneratethefull-lengthtargetcDNA.First,youcangenerate5'-and3'-RACEproductsofyourtargetcDNAthatshouldhavetheoverlappingregionbetweenthem.Theuniquerestrictionsiteshouldbepresentwithintheoverlappingregion.Second,the5'-and3'-RACEfragmentsaredigestedbytheuniquerestrictionenzymeandthedigested5'-and3'-RACEfragmentsareligatedtogeneratefull-lengthcDNARACE（了解）補(bǔ)充：TaKaRa5‘-FullRACE技術(shù)TaKaRa5’-FullRACEKit應(yīng)用了“去帽法”原理：用煙草酸焦磷酸酶(TobaccoAcidPyrophosphatase，TAP)去掉mRNA的5‘帽子結(jié)構(gòu)，加上一個(gè)Adaptor，然后使用5'Adaptor上的引物與已知序列部分的引物GSP進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，高特異性地?cái)U(kuò)增cDNA5'末端的全長(zhǎng)序列。RACE（了解）補(bǔ)充：TaKaRa5’-FullRACEAlkalinePhosphatase(CIAP)對(duì)TotalRNA中裸露的5'磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸反應(yīng)使用TobaccoAcidPyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè)磷酸基團(tuán)（了解）補(bǔ)充：TaKaRa5’-FullRACEKit

試劑盒具有以下特點(diǎn)：1.擴(kuò)增cDNA的5‘末端全長(zhǎng)序列：應(yīng)用了“去帽法”原理，可以有效擴(kuò)增cDNA的5'末端全長(zhǎng)序列。2.高靈敏度：采用了套式PCR法，對(duì)低豐度的基因或極少量的RNA樣品同樣可以進(jìn)行5'RACE實(shí)驗(yàn)。3.高特異性：套式PCR法的使用，大大提高了5'RACEDNA片段擴(kuò)增的特異性。4.長(zhǎng)片段5‘RACE擴(kuò)增：試劑盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV(RNaseH-)反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄性能良好，使長(zhǎng)片段的RT-PCR擴(kuò)增成為了可能。5.麻煩，沒有富集作用（了解）補(bǔ)充：反應(yīng)中涉及到的一些事項(xiàng)cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會(huì)很高。RACEPCR的效率還取決于總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。在進(jìn)行5‘和3’RACEPCR的時(shí)候應(yīng)該使用熱啟動(dòng)。（了解）補(bǔ)充：RACE引物的設(shè)計(jì)：基因特異性引物（GSPs）應(yīng)該是：

23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結(jié)果需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)已有的基因序列設(shè)計(jì)5‘和3‘RACE反應(yīng)的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由于兩個(gè)引物的存在，PCR的產(chǎn)物是特異性的。（了解）補(bǔ)充：如果要用重疊片段來(lái)檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200堿基。只有這樣才可以用擴(kuò)增的產(chǎn)物來(lái)鑒定設(shè)計(jì)的引物是否正確。驗(yàn)證基因特異性引物的對(duì)照：?jiǎn)蝹€(gè)引物的陰性對(duì)照：只用一個(gè)引物GSP來(lái)進(jìn)行陰性對(duì)照。這樣不應(yīng)該產(chǎn)生任何的條帶。如果可以看到明顯的產(chǎn)物，應(yīng)該改變循環(huán)的參數(shù)，或重新設(shè)計(jì)原始引物。利用兩個(gè)GSPS進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照：（只有兩個(gè)GSP可以產(chǎn)生重疊的時(shí)候才可以采用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實(shí)表達(dá)，利用兩個(gè)GSP和接頭連接的cDNA來(lái)產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。可以產(chǎn)生兩個(gè)引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個(gè)片段，應(yīng)該重復(fù)cDNA的合成，或者從一個(gè)不同的組織或細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行cDNA的合成。（了解）補(bǔ)充：

RACE產(chǎn)物的驗(yàn)證：

應(yīng)該對(duì)RACE的片段進(jìn)行驗(yàn)證,以此來(lái)確定是否已經(jīng)擴(kuò)增了理想的產(chǎn)物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗(yàn)證是非常有用的。有3種驗(yàn)證RACE產(chǎn)物的方法：（1）比較由GSP和NGSP獲得RACE產(chǎn)物。（2）Southernblot

（3）克隆并測(cè)序建議最好測(cè)得RACE產(chǎn)物的部分序列。有的時(shí)候需要嵌套引物的存在。（了解）補(bǔ)充：5.5.2cDNA差示分析法克隆基因前提：利用兩套cDNA：tester和driver，其中tester中含有少數(shù)dirver中不具有的cDNA即差異基因，除此之外，二者完全相同。原理1：利用差減雜交，去除相同的部分原理2：利用增加接頭的方法，特異指示tester，原理3：利用PCR的指數(shù)擴(kuò)增，篩選差異基因cDNA差示分析法克隆基因-RDA代表性差異分析

representationaldifferenceanalysisRDAPage192了解差減雜交中的復(fù)性動(dòng)力學(xué)testerdirver過(guò)量AA’aa’AA’a’aa’a該方法運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA，從而使原來(lái)在豐度上有差別的單鏈cDNA相對(duì)含量達(dá)到基本一致，其中就包含T組特異的序列。AA’a’aa’a充分復(fù)性不充分復(fù)性不同的差異單鏈在豐度上趨于一致T組中與D組同源的全部復(fù)性成了雜化鏈，而T組有D組中無(wú)的鏈就“富集”起來(lái)了，而且不同的豐度上有差異的鏈，各自相對(duì)的豐度趨于一致RDA技術(shù)充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板，以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜度和多次更換cDNA兩端接頭引物等方法，達(dá)到克隆基因的目的。自身退火的testerDNA，即與driverDNA有差別的特異testerDNA片段的兩端能和引物配對(duì)，有效地進(jìn)行PCR指數(shù)擴(kuò)增，其余的雙鏈分子或單鏈分子不能以這種形式擴(kuò)增，使目的片段得以富集。driverDNA與testerDNA通過(guò)多次的差減雜交和差式PCR分離的目的基因片段，經(jīng)Northern雜交驗(yàn)證后用作探針就可從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中篩選出全長(zhǎng)的基因mRNAmRNAcDNAcDNA4堿基內(nèi)切酶消化加12/24接頭消化掉12堿基短鏈補(bǔ)平PCR消化，加新的接頭消化，不加新接頭1:100混合多輪差減雜交動(dòng)力學(xué)富集T組特異的產(chǎn)物線性擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增不擴(kuò)增差異基因產(chǎn)物testerdriverRDA流程圖Page192注意書上此圖錯(cuò)誤之處：開頭的mRNA必須是testeranddriver；所謂填充材料應(yīng)為探針材料即driver；ZAI1:100混合變性雜交后應(yīng)加新的PCR，才能有三種結(jié)果；去掉“10”。新PCRcDNA差示分析法克隆基因-RDA

RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板，而以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增了目的基因片段。因?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群（representation），保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)中兩者物質(zhì)的量比就要求達(dá)到1：100或更高，經(jīng)過(guò)2-3次重復(fù)，T群體非特異性序列幾乎沒有偶然逃脫的可能性。5.4.3Gateway大規(guī)模克隆技術(shù)（了解）說(shuō)明：gateway并不是上述克隆基因的技術(shù)，而只是一種大規(guī)模將目的基因從克隆載體轉(zhuǎn)向表達(dá)載體的方法兩步完成：

TOPO反應(yīng)：PCR產(chǎn)物連入Entry載體

LR反應(yīng)：PCR產(chǎn)物從Entry載體重組入表達(dá)載體A：TOPO反應(yīng)：B：LR反應(yīng)注意教科書上p194的錯(cuò)誤：圖（b）中右側(cè)是連接反應(yīng)的結(jié)果，不應(yīng)該有表示重組的x線？5.4.4基因的圖位克隆

（map-basedcloningorPositionalcloning）根據(jù)遺傳連鎖分析和染色體步移法，將基因定位到染色體的一個(gè)具體位置上，通過(guò)篩選基因組文庫(kù)來(lái)克隆基因。圖位克隆的核心是連鎖分析技術(shù)連鎖分析即通過(guò)基因與基因之間的重組系數(shù)來(lái)估計(jì)這兩者之間的距離,若某種性狀的基因與另外一個(gè)基因在子代不分離,即有連鎖在一起的趨勢(shì)。根據(jù)已知基因的染色體位置來(lái)判斷未知的連鎖基因的染色體位置。但是已知的基因與未知基因存在連鎖關(guān)系的并不多,所以連鎖分析對(duì)克隆大多數(shù)基因存在著一定的困難。RFLP等分子標(biāo)記的出現(xiàn)使多態(tài)性基因標(biāo)記存在于整個(gè)基因組內(nèi),解決了連鎖分析中難以克服的困難。尋找連鎖基因就轉(zhuǎn)變成了尋找連鎖標(biāo)記。圖位克隆1/8p193圖位克隆的前提條件1、建立相應(yīng)的文庫(kù)，

例如BAC、YAC庫(kù)。2、要有合適的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記做篩庫(kù)的探針。圖位克隆2/8基因圖位克隆步驟（map-basedcloning）

(用于分離其編碼產(chǎn)物未知的基因，理論上任何一個(gè)有突變的基因都可以通過(guò)這種方法克隆出來(lái))

（1）根據(jù)突變通過(guò)家系分析等將基因定位在染色體上，并在目的基因兩側(cè)確定一對(duì)緊密連鎖的分子標(biāo)記（RFLP等）；

（2）利用這對(duì)分子標(biāo)記作探針，通過(guò)染色體步移(chromosomewalking)技術(shù)或者染色體顯微切割技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含有目的基因的基因組片段克隆并分離出來(lái)；圖位克隆3/8（3）確定含有目的基因的染色體片斷，也就是再進(jìn)一步做出更精細(xì)的染色體圖譜；（4）最后在這些片段中進(jìn)一步篩選目的基因，并作突變檢測(cè)驗(yàn)證和功能分析（一般是通過(guò)遺傳互補(bǔ)完成）

圖位克隆4/8染色體步移法圖示

Chromosomewalking1、首先找到一個(gè)與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，作為 起始克隆，在這個(gè)標(biāo)記附近做物理圖譜，然后以其中的標(biāo)記序列為探針；2、從基因組文庫(kù)中篩選具有重疊序的克隆1，進(jìn)一步構(gòu)建克隆1的物理圖譜；3、根據(jù)克1的物理圖譜設(shè)計(jì)新的探針如；此反復(fù)重復(fù)，可以逐步逼近，知道目的基因克隆，鑒定。p194圖位克隆5/8染色體步移解釋染色體步移的起點(diǎn)是具有一個(gè)與待分離的目的基因盡可能靠近的已經(jīng)鑒定的分子標(biāo)記。這種標(biāo)記可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。先構(gòu)建起點(diǎn)RFLP標(biāo)記克隆的限制圖，并把其中最靠近目的基因的限制片段亞克隆出來(lái)。此限制片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針，從基因組文庫(kù)中篩選與起點(diǎn)克隆具有重疊序列的新克隆（稱之為一步克?。?。重復(fù)進(jìn)行上述的各個(gè)步驟。構(gòu)建一步克隆的限制圖，亞克隆其中最靠近目的基因的限制片段，該片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針從基因組文庫(kù)中篩選與一步克隆具有重復(fù)序列的新克?。ǚQ之為二步克隆）。如此重復(fù)進(jìn)行多次，每得到一個(gè)新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后獲得了目的基因的克隆。由于這種技術(shù)是通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象地稱之為染色體步移（chromosomewalking）。圖位克隆6/8Map-basedcloningofTGD1(At1g19800).RecombinantspertotalchromosomesanalyzedintheF2populationareindicatedabovetherespectivemarkers.Complementingcosmidsaremarkedby(+)followingtheirdesignation.Theexon(thickbar)intronstructureoftheTGD1geneisshownatthebottom.Thenucleotidesubstitutionsinthethreemutantallelesareindicated.TheEMBOJournal(2003)22,2370–2379定位克隆7/85.4.5TAIL-PCRFusionprimerandnestedintegratedPCR(FPNI-PCR):anewhigh-efficiencystrategyforrapidchromosomewalkingorflankingsequencecloning在植物分子生物學(xué)研究中，經(jīng)常需要克隆已知基因的旁側(cè)序列，如分離基因的調(diào)控區(qū)，獲得完整的基因序列，特別是在轉(zhuǎn)基因作物研究中，分析外源基因插入位點(diǎn)的分子特征，對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的安全評(píng)價(jià)及應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義基因序列旁側(cè)序列