RNA分子生物學技術

RNA分子生物學技術第1頁/共118頁導論再談中心法則RNA世界RNA生物學功能RNA組學第2頁/共118頁再談中心法則第3頁/共118頁4中心法則與RNA1961年,發(fā)現(xiàn)DNA依賴的RNA聚合酶1968年,提出RNA是最早的信息分子1982~1983年,發(fā)現(xiàn)核酶

1986年,提出“RNAworld”1947年,RNA第一次被描述1968年,提出中心法則第4頁/共118頁中心法則與組學第5頁/共118頁基因組：一種生物擁有的所有遺傳信息的總合是一個細胞（或病毒）所承載的全部遺傳信息，它代表了一種生物所具有的全部遺傳信息。真核生物基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）及線粒體DNA或葉綠體DNA的全部序列，既有編碼序列，也有大量存在的非編碼序列。細菌基因組包含了擬核和質粒中的DNA序列。病毒基因組有的為DNA（DNA病毒），有的則為RNA（RNA病毒）。*基因組（genome）第6頁/共118頁基因組學：包括結構基因組學、功能基因組學和比較基因組學基因組學（genomics）是闡明整個基因組的結構、結構與功能的關系以及基因之間相互作用的科學。研究內容：結構基因組學（structuralgenomics）:

遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜以及轉錄圖譜和大規(guī)模DNA測序。功能基因組學（functionalgenomics）:分析鑒定基因組功能。比較基因組學（comparativegenomics）：基因組之間比較鑒定，研究生物進化，預測新基因。第7頁/共118頁轉錄組學：研究全部RNA的表達及功能轉錄組（transcriptome）

指生命單元（通常是一種細胞）所能轉錄出來的所有RNA——包括指導蛋白質翻譯的mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)的總和。RNA功能基因組學

又稱RNA組學（RNomics）：是分析、鑒定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定狀態(tài)下表達差異、功能及其與蛋白質的相互作用。第8頁/共118頁RNA組學：研究全部非mRNA小RNA的集合人類基因組序列特點：2萬2.5萬個基因，與蛋白質合成有關的序列占整個基因組的2%左右，其余98%的基因組序列沒有得到注釋。RNA組學研究范疇：小分子RNA，包括

snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第9頁/共118頁

以細胞、組織或機體在特定時間和空間上表達的所有蛋白質即蛋白質組（proteome）為研究對象，分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)；了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系；并在整體水平上研究蛋白質調控的活動規(guī)律，故又稱為全景式蛋白質表達譜（globalproteinexpressionprofile）分析。

蛋白質組學（proteomics）蛋白質組：全景式蛋白質表達譜分析第10頁/共118頁蛋白質組學的中心任務：

研究細胞內所有蛋白質組成及其活動規(guī)律蛋白質組學的研究內容：一、蛋白質組表達模式的研究，即結構蛋白質組學（structuralproteomics）二、蛋白質組功能模式的研究，即功能蛋白質組學（functionalproteomics）第11頁/共118頁蛋白質組學的主要任務：蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結合生物質譜、Western印跡、蛋白質芯片等技術，對蛋白質進行全面的鑒定研究。翻譯后修飾的鑒定：磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。蛋白質功能確定：包括蛋白質定位研究，蛋白質活性，蛋白質相互作用，酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基-受體結合分析等。第12頁/共118頁與蛋白質組研究相關的數(shù)據(jù)庫蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，/EMBL，http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite，http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白質二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結構數(shù)據(jù)庫（PDB，/；

FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASEhttp://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）第13頁/共118頁疾病基因組學：

研究疾病相關基因、揭示疾病發(fā)病機制疾病基因組學研究的兩大任務：疾病基因或疾病相關基因疾病易感性的遺傳學基礎第14頁/共118頁藥物基因組學：

研究遺傳變異對藥物效能和毒性的影響藥物基因組學（pharmacogenomics）是功能基因組學與分子藥理學的有機結合，它不是以發(fā)現(xiàn)人體基因組基因為主要目的，而是運用已知的基因組學知識改善患者的治療。以藥物效應及安全性為目標，研究各種基因突變與藥效及安全性的關系，是研究高效、特效藥物的重要途徑，通過它為患者或者特定人群尋找合適的藥物。使藥物治療模式：診斷定向治療→基因定向治療。第15頁/共118頁腫瘤基因組解剖工程：

闡明腫瘤相關基因

基因激活和/或失活及其復雜的相互作用是腫瘤發(fā)生的根本原因

癌癥基因組解剖計劃（CancerGenomeAnatomyProject，CGAP；又稱腫瘤cDNA工程）：擬逐步建立人類腫瘤細胞表達基因索引發(fā)展快速分析腫瘤細胞的技術獲知與腫瘤相關的基因、蛋白質及其他生物標記物建立腫瘤研究信息（數(shù)據(jù)與分析工具）、資源（克隆和文庫）及技術和方法學平臺第16頁/共118頁代謝組學（metabonomics）

測定一個生物/細胞中所有小分子（Mr1000）組成，描繪其動態(tài)變化規(guī)律，建立系統(tǒng)代謝圖譜，并確定這些變化與生物過程的聯(lián)系。

生命過程的表觀、生物化學的終極目標。代謝組學：研究內源性代謝物質的動態(tài)變化

規(guī)律及與生物過程的聯(lián)系第17頁/共118頁代謝組學分為4個層次：①代謝物靶標分析（metabolitetargetanalysis）②代謝譜分析（metabolicprofilinganalysis）③代謝組學（metabonomics）④代謝指紋分析（metabolicfingerprintinganalysis）代謝組學研究對象：生物體液——血樣、尿樣等完整的組織樣品、組織提取液和細胞培養(yǎng)液（一）代謝組學的任務：

分析生物/細胞代謝產物的全貌第18頁/共118頁

主要的分析工具①核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）：

氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）及磷譜（31P-NMR）。②MS：

MS按質荷比（m/z）進行各種代謝物的定性或定量分析，可得到相應的代謝產物譜。③色譜及聯(lián)用技術：

使樣品的分離、定性、定量一次完成，具有較高的靈敏度和選擇性。（二）代謝組學的主要分析工具：

核磁共振、色譜及MS第19頁/共118頁代謝組學研究側重于代謝物的組成、特性與變化規(guī)律，與生理學的聯(lián)系更加緊密。疾病→機體病理生理過程變化→代謝產物的改變→比較分析與正常人的代謝產物差異→發(fā)現(xiàn)和篩選出疾病新的生物標記物→對相關疾病作出早期預警→發(fā)展新的有效的疾病診斷方法。藥物代謝組學的研究，可闡明藥物在不同個體體內的代謝途徑及其規(guī)律，將為合理用藥和個體化醫(yī)療提供重要依據(jù)。（三）代謝組學：

是開展預測醫(yī)學和個體化醫(yī)學的重要手段第20頁/共118頁RNA世界

RNA是一種可以作為信使、酶和結構組分的多功能分子。

RNA與DNA、蛋白質，甚至RNA本身都能發(fā)生相互作用，在生命活動的各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要功能。大量非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)及其生物學功能多樣性被揭示。核酶的發(fā)現(xiàn)使得人們相信在生命的進化過程中曾經(jīng)存在著一個活躍的RNA世界。

人們認識到RNA的研究在揭示生命本質和疾病防治方面都有著不可或缺的意義。第21頁/共118頁1982-1983年，ThomasCech和SidneyAltman等分別發(fā)現(xiàn)RNaseP的RNA亞基和嗜熱四膜蟲的前體rRNA中的居間序列(Interveningsequence．IVS)都具有酶的催化活性，它們是最早被發(fā)現(xiàn)的具有催化作用的RNA分子——核酶（ribozyme），為RNA轉錄后加工機制提供了新的認識，并為生命起源的探討開拓了新的境界。1986年，WalterGilbert創(chuàng)造了“RNAworld”這個名詞，用于描述其提出的關于分子起源的假說：在生命進化的早期存在一個只有RNA，沒有DNA和蛋白質的世界；RNA既是遺傳信息載體又具有酶的催化功能，它們催化自身的合成。

第22頁/共118頁“RNA世界”目錄TheRNAWorld

(ThirdEdition,2006)RaymondF.GestelandThomasR.CechJohnF.Atkins

ColdSpringHarborLaboratoryPress第23頁/共118頁一、起源于RNA與RNA起源1.RNA的歷史、化學、地理生物學2.對RNA世界起源認識的進展3.原始細胞：包含遺傳聚合體的膜囊泡第24頁/共118頁二、建立功能RNA4.核糖開關與RNA世界5.自我切割核酸酶的催化策略：RNA世界的遺跡？6.I型內含子如何起作用：RNA結構與功能的范例研究第25頁/共118頁三、退出古老的RNA世界——合成酶與核糖體7.RNA、脂質、膜8.氨基酰-tRNA合酶9.RNA在蛋白質合成中的作用10.從RNA世界進化而來的核糖體與蛋白質翻譯第26頁/共118頁四、現(xiàn)代RNA世界中豐富的RNA角色11.核糖核蛋白世界12.不斷擴展的小核內核糖核蛋白世界13.剪接體結構與功能14.RNA分子位點特異性修飾的范例：尿嘧啶插入、缺失

RNA編輯15.端粒酶RNA16.形狀多變的mRNA：折疊的得與失第27頁/共118頁五、RNA繼續(xù)戰(zhàn)勝DNA

17.II型內含子：一類剪接RNA并入侵DNA的核酶

18.SINE和LINE：麻煩制造者、破壞者、先行者

19.短RNA生物學

20.細菌內小RNA調控子的多能性

21.參與哺乳動物基因劑量調控的長鏈非編碼RNA第28頁/共118頁六、新興工具

22.RNA二級結構預測

23.一種用于全原子RNA建模的模塊層次方法

24.功能RNA序列的自動化體外篩選與芯片應用

25.基于單分子方法的RNA折疊、展開、動力學研究第29頁/共118頁RNA有何基本特點與功能？第30頁/共118頁RNA與蛋白質共同負責基因的表達和表達過程的調控。RNA通常以單鏈的形式存在，但有復雜的局部二級結構或三級結構。RNA比DNA小的多。RNA的種類、大小和結構遠比DNA表現(xiàn)出多樣性。RNA的基本特點

第31頁/共118頁RNA生物學功能構成核糖核蛋白體小核內核糖核蛋白世界剪接體結構與功能RNA分子位點特異性修飾的范例：尿嘧啶插入、缺失RNA編輯端粒酶RNA形狀多變的mRNA：折疊的得與失第32頁/共118頁RNA的種類、分布、功能第33頁/共118頁CrystalStructureoftheRibosomeat5.5

?

ResolutionScience.2001.292:883-896.MaratM.Yusupov,1*GulnaraZh.Yusupova,1*AlbionBaucom,1KateLieberman,1ThomasN.Earnest,2J.H.

D.Cate,3HarryF.Noller1

1CenterforMolecularBiologyofRNA,SinsheimerLaboratories,UniversityofCaliforniaatSantaCruz,SantaCruz,CA95064,

USA.

2BerkeleyCenterforStructuralBiology,PhysicalBiosciencesDivision,LawrenceBerkeleyNationalLaboratory,Berkeley,CA94720,

USA.

3WhiteheadInstitute,Cambridge,MA01242,

USA.

第34頁/共118頁TheStructuralBasisofRibosomeActivityinPeptideBondSynthesis

Science.2000.289:920-930.PoulNissen,1*JeffreyHansen,1*NenadBan,1*PeterB.Moore,1,2ThomasA.Steitz1,2,3

1DepartmentofMolecularBiophysicsandBiochemistryand

2DepartmentofChemistry,YaleUniversity,and

3HowardHughesMedicalInstitute,NewHaven,CT06520-8114,USA.

*

Theseauthorscontributedequallytothiswork.第35頁/共118頁RNA組學第36頁/共118頁RNA組學研究全部非mRNA小RNA的集合人類基因組序列特點：2萬2.5萬個基因，與蛋白質合成有關的序列占整個基因組的2%左右，其余98%的基因組序列沒有得到注釋。RNA組學研究范疇（小分子RNA）包括：snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第37頁/共118頁NoncodingRNAs(ncRNAs)ineukaryotesSmallRNA(sRNA)inbacteriaSmallnuclearRNAs(snRNAs)SmallnucleolarRNAs(snoRNAs)MicroRNA(miRNA)SmalltemporalRNAs(stRNAs)SmallinterferingRNAs(siRNAs)RNAinterference(RNAi)GuideRNAs(gRNAs)tRNA/mRNA:tmRNA非編碼RNA的名稱與縮寫符號第38頁/共118頁RNA研究的進步

與RNA技術的發(fā)展密切相關第39頁/共118頁RNA研究相關技術第40頁/共118頁RNA研究相關技術

RNA技術可以分為：RNA基礎研究相關的技術、RNA應用相關的技術、RNA生物信息學技術.

RNA基礎研究相關技術包括RNA分離純化和鑒定技術、RNA與其他生物大分子相互作用技術、RNA高級結構的研究技術和其他相關RNA技術;RNA應用相關技術則包括用于生產其他產品的RNA技術和直接用于藥物開發(fā)的RNA技術;RNA的生物信息學技術則有各種數(shù)據(jù)庫、非編碼RNA的預測、RNA二級結構預測和各種設計軟件.第41頁/共118頁第一節(jié)

RNA基礎研究相關技術第42頁/共118頁RNA基礎研究相關技術大致可分為四類：RNA分離純化和鑒定技術、RNA與其他生物大分子相互作用技術、RNA高級結構的研究技術其他相關RNA技術。第43頁/共118頁RNA分離純化和鑒定技術

RNA分離純化和鑒定技術是幾乎所有RNA基礎研究的基點。（1889年，Altmann第一次分離純化出不含蛋白質的核酸制品。

1893年，Kossel提出，酵母來源的核酸含有核糖，RNA的研究正式開始。）

現(xiàn)在各種材料的RNA提取和純化均包括三個步驟：破碎細胞釋放其內含物、非RNA物質的去除、RNA的濃縮。

Trizol的技術是目前應用最廣泛和最著名的方法之一。對于稀有樣本還聯(lián)合體外轉錄發(fā)展了總RNA擴增技術(cRNA擴增)。第44頁/共118頁RNA可利用體外轉錄體系合成利用體外轉錄體系（invitrotranscriptionsystem）合成RNA是分子生物學常用技術。這種體外轉錄體系是現(xiàn)代發(fā)展起來的體外轉錄（invitrotranscription）技術——在含有RNA聚合酶（轉錄酶）、必要的蛋白質因子、核苷三磷酸等條件的體外無細胞體系中，加入DNA模板，模仿體內轉錄、生成RNA的過程。利用真核細胞核抽提物（nuclearextract）建立再造體系是當前生物技術商家提供體外轉錄商品試劑盒（kit）的主要來源。第45頁/共118頁總RNA的分離純化

總RNA的分離純化技術已經(jīng)相當完善，目前和將來的重要發(fā)展方向是RNA的進一步分級分離，其中小RNA的分離是研究的熱點。目前主要有兩種：一是利用電泳根據(jù)分子大小分離；二是利用不同濃度的有機溶劑的沉降或吸附效率不同分離。第46頁/共118頁Trizol技術

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。

特點：

1.Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作

2.RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意配帶手套，樣品盡可能蓋嚴

3.細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之后要看不見顆粒狀物質（結締組織和骨除外）。在清洗和裂解細胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA

4.酵母和一些細菌由于細胞壁的特殊結構，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分

5.2-8℃避光保存一年

第47頁/共118頁準備工作

RNA酶（RNase）是導致RNA降解最主要的物質。此酶非常穩(wěn)定，在一些極端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的RNase完全失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用以DEPC配制的乙醇擦洗取液器的內部和外部，可基本達到要求

3.塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

（1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。已標明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理

第48頁/共118頁

處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強的劇毒物，須在通風櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風柜中37℃或室溫下處理過夜

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC-H2O處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用

第49頁/共118頁（2）玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時以上

DEPC(二乙基焦碳酸酯)

DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性

DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心

試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性

但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理

第50頁/共118頁實驗步驟

1.取50~100mg的組織,加入1mlTrizol試劑，用勻漿器打勻(Trizol先放于冰上)

2.將勻漿室溫放置5min

3.加入200μl氯仿,劇烈震蕩混勻30s，冰上靜置3min

4.12000rpm，4℃離心15min

5.將上清液小心轉移到新的1.5ml離心管中（取400μl），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質，寧缺勿爛。）

6.12000rpm，4℃離心15min

7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失

第51頁/共118頁

8.用70%乙醇（DEPC處理的水配制）洗滌1次，加入700μl乙醇，將RNA沉淀彈起，漂洗。（此時RNA是不溶解的）

9.8000rpm，室溫離心10min

10.盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失

11.真空離心干燥3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉

12.沉淀用30μlDEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68℃處理10min

第52頁/共118頁

13.RNA檢測

(1)測定樣品在260nm和280nm的吸光值按

1OD=40μg/mlRNA計算RNA的產量

OD260/OD280在1.8-2.0

(2)進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染情況第53頁/共118頁RNA鑒定

RNA鑒定技術，主要是分析RNA的量、大小、豐度、定位、剪切、修飾和序列等信息

純化的RNA可通過光譜分析和定量分析特定RNA大小最常用的技術是Northern雜交技術，它是由Alwine等在1977年建立的

第54頁/共118頁核酸定量（DNA或RNA的定量）A260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA(dsDNA)40μg/ml單鏈DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸確定樣品中核酸的純度

純

DNA:A260/A280=1.8

純

RNA:A260/A280=2.0核酸紫外吸收第55頁/共118頁衡量特異mRNA豐度方法

經(jīng)典的衡量某一特異mRNA豐度的方法的有：Northern雜交核糖核酸酶保護定量的反轉錄PCR

等為研究異質細胞群中RNA和DNA序列的定位，還發(fā)展了原位雜交術目前這方面的技術發(fā)展方向是大規(guī)?；透咄?，其中基因芯片技術有著相當大的優(yōu)勢第56頁/共118頁RNA加工修飾鑒定技術

有關RNA加工修飾的鑒定技術有多種

其中利用核酸酶對RNA進行作圖，定位內含子和外顯子；通過核提取物等進行體外剪切分析。最近發(fā)展的基因芯片技術可以高通量地分析RNA剪接。

與RNA修飾和RNA編輯研究相關的技術主要有：

snoRNA指導的2‘-O-核糖甲基化修飾鑒定技術假尿苷化修飾鑒定技術

mRNA的各種編輯鑒定技術等第57頁/共118頁

另外，利用引物延伸法、S1核酸酶法等可以進行RNA末端鑒定。

近年來發(fā)展的CAGE(capanalysisgeneexpression)，SAGE(serialanalysisofgeneexpression)等技術可以實現(xiàn)RNA末端大規(guī)模鑒定。

其基本原理是在RNA5‘端加上帶酶切位點的接頭，酶切后可產生帶有5’端序列的短片段，經(jīng)過連接和測序，即可獲得大量5‘Tag序列信息。通過分析Taq的頻率可同時估計基因的表達情況。第58頁/共118頁小RNA豐度測定

隨著siRNA、microRNA、snoRNA等非編碼RNA研究的不斷深入，小RNA的分析和鑒定技術也逐步完善。目前有關小RNA豐度測定主要是利用改進反轉錄PCR技術，常見有三種方案：一、在兩端加RNA接頭二、通過在3‘端加polyA尾模擬mRNA三、利用stem-loop反轉錄引物技術

第59頁/共118頁

前兩者同樣可用于小RNA文庫的構建，之后通過測序，可以獲得小RNA的序列信息，在大規(guī)模實驗的條件下，根據(jù)獲得的克隆頻數(shù)也能分析相應的表達水平。也有一小部分小RNA序列是在生物信息學預測的結果基礎上進一步驗證獲得的。

目前，高通量小RNA分析鑒定技術常用的是改進的非編碼RNA芯片技術；對于特定的小RNA的分析鑒定除上述技術以外還有改良的Northern技術等。第60頁/共118頁克隆ncRNA的方法計算機分析法基因克隆法蛋白質-RNA分離法第61頁/共118頁計算機分析法大致過程：

利用計算機軟件從已知基因組序列中尋找基因間區(qū)中的snoRNA序列，然后模擬其高級結構，設計引物擴增其序列和克隆，或人工合成其序列，測定其功能。第62頁/共118頁小RNA的克隆和鑒定小鼠腦組織勻漿總RNA8%PAGE回收50-110nt(fractionI)和110-500nt(fractionII)Poly(A)聚合酶加C尾cDNApSPORT1PCR高密度陣列雜交除去高豐度、已知的小RNA未雜交的cDNA測序詳見：http://exppc01.uni-muenster.de/expath/snmrnas.htm第63頁/共118頁蛋白質-RNA復合物分離法分離蛋白質-RNA復合物，除去蛋白質，純化RNA分子，反轉錄成cDNA，克隆，測序，結果分析。

所得RNA的cDNA克隆必須進行Northern雜交，以確認其轉錄物大小是否相符。第64頁/共118頁RNA與其他大分子相互作用研究技術

RNA與蛋白相互作用在基因表達調控中發(fā)揮著重要作用，相應的技術也與細胞技術和蛋白質技術交叉。通過光交聯(lián)進行RNA的體外修飾并增加RNP的穩(wěn)定性，利用凝膠阻滯和硝酸纖維素濾膜結合實驗技術分析RNA-蛋白質作用常數(shù)，用免疫共沉淀技術分離特異的RNP。

RNA足跡、修飾干擾分析和RNP中寡核苷酸靶向的RNaseH切割保護實驗技術也常用于鑒定重要的蛋白質結合位點。第65頁/共118頁

目前這方面研究也有向大規(guī)模發(fā)展的趨勢，主要有兩種方案：

一是在細胞水平利用光交聯(lián)技術后，通過免疫共沉淀或者其他親和技術，獲取某個或某類蛋白的所有結合RNA基序，進一步通過分離純化和測序等，獲得RNA與蛋白質的相互作用信息。反過來，利用標記的RNA或者已知的RNA結合蛋白也可獲得相應與RNA相互作用的蛋白或其他大分子，再通過蛋白質組技術獲得相應信息。如RNAi和microRNA作用過程中許多新蛋白的發(fā)現(xiàn)就是通過這種技術完成的，從而逐步揭示了細胞內RNA干擾的分子機制。第66頁/共118頁

二是利用各種文庫篩選技術，如酵母三雜交技術、噬菌體展示技術、核糖體展示技術、抑制細菌轉錄終止檢測技術、Northwestern技術等篩選RNA結合蛋白?；蚍催^來通過構建天然或人工RNA文庫篩選與蛋白質特異結合的RNA序列。第67頁/共118頁

RNA與DNA或RNA的相互作用也是基因調控的重要方面

如siRNA或microRNA與靶mRNA的結合，導致靶mRNA的降解或翻譯抑制；或者與靶DNA結合指導DNA的甲基化等。從這也衍生出許多相關的實驗技術，例如microRNA的實驗性尋靶技術。第68頁/共118頁RNA高級結構研究技術

RNA高級結構、RNA與其結合蛋白的高級結構是RNA研究的重要組成部分。

RNA在體內是以RNP形式存在的，因此研究RNP的結構更具有意義。與之相關技術有各種顯微技術、X光晶體衍射技術和磁共振技術等。

（高分辨率核糖體晶體結構的解析、Argonaute蛋白晶體結構的研究等都是這些技術發(fā)展的成果，并為RNAi機制的闡明起到巨大幫助。）第69頁/共118頁其他RNA研究相關技術

在RNA的研究中不可避免的會遇到RNA降解問題，這就需要利用RNA保存技術，這是RNA研究中最基礎也是最重要的技術之一。各種RNA工具酶如RNA聚合酶、RNA酶、RNA連接酶和反轉錄酶的發(fā)現(xiàn)，使得進行RNA操作更加方便和容易，從而也促進RNA技術不斷創(chuàng)新，應用范圍更加廣泛。第70頁/共118頁獲得已知序列的RNA分子

無論基礎或應用研究中，都有可能需要大量獲得已知序列的RNA分子。

RNA合成技術包括：體外轉錄合成技術直接化學合成技術體內合成技術利用tRNA骨架在體內大量表達出研究者需要RNA分子第71頁/共118頁第二節(jié)

RNA應用相關技術第72頁/共118頁RNA應用相關技術

雖然RNA的研究蓬勃開展，但是在相當長的時間里RNA還主要停留在基礎研究階段。

直到20世紀80年代末，核酶專利的出現(xiàn)使得RNA應用技術的研究迅速升溫。從新RNA應用技術的建立到專利出現(xiàn)的時間差也在不斷縮短。

這方面技術也可大致分為兩大類：

用于生產其他產品的RNA技術直接用于藥物開發(fā)的RNA技術。

第73頁/共118頁

用于生產其他產品的RNA技術主要是指蛋白質合成方面，如蛋白質的體外合成

將RNA的體外合成技術與蛋白質體外合成系統(tǒng)聯(lián)合在一起可以制備許多生物工程技術不能生產的毒蛋白、人工合成氨基酸摻入蛋白質等

大規(guī)模蛋白質體外合成技術必將是今后RNA應用技術發(fā)展的一個重要方向

第74頁/共118頁多聚核蛋白體(polysome)：mRNA與多個核糖體的聚合物——使蛋白質合成以高速度、高效率進行目錄第75頁/共118頁電鏡下的多聚核糖體現(xiàn)象目錄第76頁/共118頁rRNA與蛋白質組成核糖體

目錄

蛋白質合成場所第77頁/共118頁核糖體的組成目錄原核生物核糖體70SMt2.7×106

真核生物核糖體80SMt4.2×106第78頁/共118頁直接用于藥物開發(fā)的RNA技術

目前應用較廣泛的主要有：反義核酸(狹義的)技術、核酶技術、SELEX技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)、RNA干擾、引誘物(decoy)技術上述各種技術獲得的RNA或DNA及其類似物的作用都是抑制基因表達，因此，這些分子本身可作為各種疾病治療用的藥物許多這方面的藥物已經(jīng)獲準上市或處于臨床研究階段第79頁/共118頁反義核酸技術

1978年，Zamecnik等證明特異互補的寡核苷酸在體外能有效地抑制Rous肉瘤病毒(RSV)增殖。

1984年，Izant和Weintraub等首次提出反義核酸技術(antisensetechnology)的概念。

反義技術：

指根據(jù)堿基互補原理，用人工或生物體合成的特異互補的DNA或RNA片段(或其化學修飾產物)抑制或封閉目的基因表達的技術。

第80頁/共118頁

廣義地講，反義寡核苷酸技術、反義RNA技術、核酶技術、RNAi技術等都屬于反義技術范疇。

目前，傳統(tǒng)的反義核酸藥物已經(jīng)發(fā)展到了第三代，主要包括肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)、鎖定核酸(lockednucleicacid，LNA)等多種化學修飾的寡核苷酸。第一個反義核酸藥物(VitravenekTM)已經(jīng)進入商業(yè)市場，還有多種反義核酸進入III期臨床試驗。第81頁/共118頁核酶技術

幾乎在發(fā)現(xiàn)反義RNA的同時,人們發(fā)現(xiàn)了一類具有酶活性的單鏈RNA分子，即核酶(ribozyme)1982年，Cech首先提出Ribozyme的概念，并認為核酶在生物體內普通存在核酶發(fā)現(xiàn)的意義：改變了酶的化學本質是蛋白質的傳統(tǒng)概念，揭示了RNA在生物體內的多功能特性，RNA既是遺傳物質,還具有多功能的催化作用，是生命科學發(fā)展過程又一里程碑

第82頁/共118頁83一些內含子RNA具有自我剪接和催化功能由RNA分子催化自身內含子剪接的反應稱為自我剪接(self-splicing)自身剪接內含子的RNA具有催化功能，是一種核酶(ribozyme)

四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式第83頁/共118頁

核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子。核酶又稱核酸類酶、酶RNA、類酶RNA。核酶的功能很多,有的能夠切割RNA,有的能夠切割DNA,有些還具有RNA連接酶、磷酸酶等活性。核酶通過催化轉磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應參與RNA自身剪切、加工過程。

與蛋白質酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。第84頁/共118頁

核酶技術原理：

核酶RNA分子通過堿基配對原則與靶mRNA結合發(fā)揮酶活性，在特定的位點特異性滅活靶RNA分子，同時兼具反義抑制效果。

核酶可以在體外合成，也可以經(jīng)表達載體導入后在細胞內合成。

脫氧核酶(deoxyribozyme)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有催化活性的單鏈DNA分子。脫氧核酶兼具ASON反義抑制作用和核酶的靶向性剪切活性等雙重優(yōu)勢，而且穩(wěn)定性較好。第85頁/共118頁核酶類型到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)的核酶共有6種類型：I類內含子RNaseP錘頭狀核酶發(fā)夾狀核酶丁型肝炎核酶VS核酶

第86頁/共118頁

通過對這6類核酶組成及結構的研究，人們利用錘頭狀、發(fā)夾狀、斧頭狀核酶的特點，人工合成所需要的核酶。錘頭狀核酶的二級結構是由核酶和底物復合物組成的三個莖環(huán)結構。

RNA底物通過二個莖環(huán)結合到核酶上，切割位點由一個非配對堿基及與之相連的二個莖環(huán)結構組成。切割發(fā)生在非配對的3’側，切割產物5’端是羥基。3`端是一個2’3’環(huán)磷酸二酯，核酶催化水解底物需要被水解部有一個特殊的三聯(lián)密碼，NUX、(N{G、A．U；XA、U，C)當三聯(lián)碼為GUC時，被水解的活性最高。第87頁/共118頁核酶技術的特點①序列特異性；②不編蛋白質，無免疫原性；③可以重復利用，所以研究進展迅速第88頁/共118頁SELEX技術第89頁/共118頁SELEX技術

適配分子技術是一種最近發(fā)展起來的體外篩選和放大技術，通過該技術可得到一段能與各種目標分子高親和、高特異結合的核酸序列，該核酸序列稱之為適配分子(aptamer)。

Aptamer一詞來源于拉丁文Aptus，意即適合的意思(fit)，而這種體外的篩選技術稱之為指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進化技術即SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)。簡言之，Aptamer就是一段核酸序列，它能與相應的配體高特異性和高親合力地結合。從原始文庫中篩選配體相應的Aptamer的技術稱為SELEX技術。

Aptamer具有廣泛的實用性，它能用于任何以分子識別為基礎的診斷和治療。第90頁/共118頁原理

從大量的隨機序列的寡核苷酸庫中鑒定出一種數(shù)量很少的具有獨特性質的核酸序列的方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一種通過體外反復選擇和放大從巨大的核苷酸組合庫中篩選特定核苷酸序列的方法。

SELEX過程中，首先是用組合化學合成DNA的方法合成隨機序列的核酸庫，庫中的每一個成員是一個線形的寡聚物，庫中分子多樣性的程度取決于隨機寡核苷酸的長度。理論上講，一個40個堿基的隨機序列可有1.2X1024種核苷酸排列順序(440=1.2X1024)。實際上1μmol的固相DNA合成的隨機組合核苷酸庫的序列多樣性僅限制于1014—1015種，能否找出與靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取決于組合庫的多樣性，在所有種類的組合隨機序列庫中寡核苷酸庫的多樣性最為豐富。

篩選過程中，首先在一定的溫度下將寡核苷酸隨機序列庫與靶分子共同孵育于特定的緩沖液中，組合庫中的極少數(shù)分子將與靶分子結合，然后用物理的方法將結合的分子與末結合的分子分離開來。標準的方法是將蛋白靶分子固定于硝酸纖維素濾膜上，而其他小的靶分子則固定于固相載體的表面，因此，未與靶分子結合的序列很容易被沖洗掉，而與靶分子結合的序列將被分離出來并放大以獲得一個序列庫，再對這一序列庫進行下一輪的篩選和放大。

第91頁/共118頁SELEX技術原理第92頁/共118頁

由于aptamer具有精確識別、易體外合成與修飾等特性，SELEX技術在分析化學、基因調控、蛋白質組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面得到廣泛的應用。更重要的是，aptamer的靶分子范圍很廣，與靶分子間的親和力和特異性更高，從SELEX技術建立至今，SELEX技術和aptamer的研究不斷受到新的挑戰(zhàn)與更新。第93頁/共118頁SELEX技術改良

經(jīng)過15年的發(fā)展，SELEX技術不斷得到改進與完善，實現(xiàn)了篩選流程的自動化、篩選形式的多樣化、篩選結果的快速化，aptamer也有了多種應用形式。

各種改良SELEX技術：自動化SELEX消減SELEX(subtractiveSELEX)毛細管電泳SELEX(CE-SELEX)加尾SELEX(tailoredSELEX)無引物基因組SELEX(primer-freegenomicSELEX)切換SELEX(togglingSELEX)表達盒SELEX(expressioncassetteSELEX)變構篩選(allostericselection)

利用SELEX技術篩選獲得的針對VEGF的RNA配基(aptamer)已經(jīng)獲得美國FDA批準上市，商品名為Macugen，用于老年性視網(wǎng)膜黃斑營養(yǎng)不良(AMD)的治療。第94頁/共118頁RNA干擾技術

早在1990年，人們就發(fā)現(xiàn)植物中存在轉錄后基因沉默現(xiàn)象。

1995年，康乃爾大學的Guo在利用反義RNA技術特異性地抑制秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中的par-1基因的表達時，意外發(fā)現(xiàn)對照實驗中給線蟲注射正義RNA(senseRNA)也能抑制par-1基因的表達。直到1998年，F(xiàn)ire和Mello才首次揭示雙鏈RNA能夠特異抑制具有相同序列的靶mRNA的表達，并將這一現(xiàn)象稱為RNA干涉(RNAinterference，RNAi)。在隨后的短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)真核生物中，RNAi技術也被迅速應用到生命研究的各個領域。

第95頁/共118頁

目前，RNAi技術作為基因功能研究和疾病基因治療的革命性工具，已經(jīng)在醫(yī)藥開發(fā)、基因治療和功能基因組研究等方面得到廣泛應用，并于2006年獲得諾貝爾獎。

RNAi技術的作用基礎是siRNA的基因沉默作用。第96頁/共118頁RNA干擾

一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內特定基因表達,促使ｍRNA降解,誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi,也譯作RNA干預或者干涉)。第97頁/共118頁RNA干擾原理第98頁/共118頁RNAi－一種新的遺傳學研究工具RNAi是植物、果蠅、線蟲和很可能包括哺乳動物在內的許多生物抵抗病毒感染和限制轉座子運動的一種自然存在的防御機制。RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個體,從而研究該基因的功能.它正在功能基因組學領域掀起一場真正的革命,并將徹底改變這個領域的研究步伐,為此被SCIENCE評為2002年最重要的科研成果之一。在哺乳動物細胞中用siRNA(21－23核苷酸長的小分子干擾ＲＮＡ片段(smallinterferingRNAs,siRNAs,又被稱為引導RNAs)。能高效阻斷某個特定基因的表達,這項技術在疾病的基因治療上也有光明的應用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達,或者由蛋白過量表達引起的疾病。第99頁/共118頁共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

ＲＮＡｉ研究的早期線索早在20年前,來自于美國和荷蘭的兩個轉基因植物實驗組Richjorgensen和同事,在對矮牽牛(petunias)進行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個能產生色素的基因置于一個強啟動子后,導入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression),因為導入的基因和其相似的內源基因同時都被抑制。開始這被認為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象,后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中,甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。

第100頁/共118頁第101頁/共118頁基因沉默

轉錄階段基因沉默(transcriptionalgenesilencing,orTGS)：

對于部分植物來說,轉基因引發(fā)的基因沉默可能是因為基因特異的甲基化而導致,這被稱為轉錄階段基因沉默.轉錄后發(fā)生的基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,orPTGS)：Ｈａｍｉｌｔｏｎ等,率先在發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿中檢測出與被沉默基因同源的約25ｎｔ的短片段ＲＮＡ,而未發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿則不能檢出25ｎｔ的ＲＮＡＨａｍｉｌｔｏｎＡＪｅｔａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ,1999,286(5441):950—952

第102頁/共118頁第103頁/共118頁第104頁/共118頁

目前在體內或體外RNAi中應用的siRNA主要有兩種來源：體外化學合成或轉錄的siRNA和利用DNA載體在細胞內轉錄產生。由化學合成或體外轉錄的方法得到~21nt的siRNA，目前應用得最廣泛。尤其是經(jīng)過修飾后提高穩(wěn)定性的siRNA仍可表現(xiàn)特異的基因沉默作用，為其在體內的應用提供了可能的前景，而且目前的研究表明，無論在細胞或動物體內，應用此類siRNA均不影響體內miRNA的表達和功能，進一步說明siRNA應用的可靠性。

第105頁/共118頁

也有根據(jù)靶基因mRNA設計的長dsRNA經(jīng)Dicer剪切成一系列~21nt的siRNA(統(tǒng)稱為esiRNA)，能更有效、更方便地抑制基因的表達，但是其缺點是可能存在非特異效應。隨著miRNA研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)根據(jù)miRNA設計的發(fā)夾RNA，或基于