GFP綠色熒光蛋白

GFP綠色熒光蛋白第1頁/共29頁GFP的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個(gè)峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,因此為熒光素FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察。盡管450～490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰,但由于長(zhǎng)波能量低,細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測(cè)。第2頁/共29頁GFP的性質(zhì)GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)，特別在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。第3頁/共29頁GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析。但因?yàn)镚FP不是酶,熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。第4頁/共29頁ComparisonofGFPandLuciferaseImaging

MethodMinimumcellsimageableinvitroMinimumcellsimageableinvivoNeedforsubstrate?Needforanesthesia?MethodofvisualizationMulticolorimagingGFP11NoNoDirectImagingYesLuciferase3003000YesYesPhotoncounting(pseudo-color)No第5頁/共29頁GFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用GFP作為新型報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因研究GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動(dòng)及相互作用研究活細(xì)胞分子變化過程發(fā)育分子機(jī)理研究示蹤病原菌臨床檢驗(yàn)在腫瘤研究中的應(yīng)用第6頁/共29頁GFP在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的應(yīng)用GFP在檢測(cè)腫瘤血管形成方面的應(yīng)用FP在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用第7頁/共29頁GFP在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用GFP是一個(gè)分子量較小的蛋白,易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP與目的基因融合,將目的基因標(biāo)記為綠色,即可定量分析目的基因的表達(dá)水平,顯示其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化,為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。第8頁/共29頁在腫瘤的形成過程中,增殖和凋亡是一對(duì)相互矛盾的統(tǒng)一體。若腫瘤細(xì)胞凋亡占優(yōu)勢(shì),腫瘤組織將長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài)或自行消亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控。用GFP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,并與正常組織進(jìn)行比較,若過表達(dá),則大致可判斷此基因?yàn)橐种颇[瘤細(xì)胞凋亡的基因;反之,為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因。第9頁/共29頁腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)是腫瘤細(xì)胞粘連、酶降解、移動(dòng)和基質(zhì)內(nèi)增殖等一系列過程的表現(xiàn),其根本原因在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因表達(dá)異常。利用GFP的示蹤特性,研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系,即可揭示腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的某些機(jī)制。第10頁/共29頁GFP在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的應(yīng)用研究腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的傳統(tǒng)方法是將載瘤動(dòng)物分階段處死,做成光學(xué)或免疫組化切片進(jìn)行觀察,或采用CT、ECT、MRI、PET等影像儀器進(jìn)行檢測(cè)。為了詳細(xì)了解腫瘤的生物學(xué)行為特征,即使使用大量的動(dòng)物和昂貴的設(shè)備,也難以對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、瘤體形成過程進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的觀察。曾有報(bào)道將標(biāo)記了熒光染料的腫瘤細(xì)胞經(jīng)血管注射到動(dòng)物體內(nèi),研究轉(zhuǎn)移病灶形成過程,但由于標(biāo)記后腫瘤細(xì)胞的熒光信號(hào)很易衰減,加上腫瘤細(xì)胞分裂,通常2～3d后便難以顯示或跟蹤經(jīng)熒光標(biāo)記過的腫瘤細(xì)胞。第11頁/共29頁為了克服上述缺陷,Yang等建立了一種在活體內(nèi)可連續(xù)、重復(fù)、動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及瘤體形成過程的方法。第12頁/共29頁第13頁/共29頁Externalwhole-bodyimagesoftheBxPC-3-GFPprimarytumorcomparedwithinternalimages.A,fluorescentimagesoftheprimarypancreatictumor(P),omental(O),bowel(B),andspleen(S)metastases.B,animageofthesamemouseafterlaparotomyinternallylocalizedtheexternalimagesofmetastatictumors.第14頁/共29頁第15頁/共29頁第16頁/共29頁第17頁/共29頁初步經(jīng)驗(yàn)顯示,熒光的強(qiáng)弱與腫瘤大小、深度有關(guān),腫瘤位于皮下0.5mm時(shí),可檢測(cè)到的最小瘤灶為59μm;距皮下2.2mm時(shí),能夠檢測(cè)到的瘤體約為1.8mm;深在部位的腫瘤,其所發(fā)出的熒光由于受周圍組織,尤其是皮膚的干擾,小的瘤灶常難以顯示。為此,Yang等在欲檢測(cè)的器官做一個(gè)可逆性的皮瓣,觀察時(shí)打開皮瓣,建立一條熒光通路,大大提高了檢測(cè)的敏感性,從而可檢測(cè)出腦內(nèi)、肝內(nèi)單個(gè)腫瘤細(xì)胞,以及由數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞形成的肺內(nèi)微小瘤灶。第18頁/共29頁Bladdercancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

liver

lung

pancreas

spleen

diaphragm

omentumKU-7-GFPhumanbladdercarcinomagrowingonnudemousebladder

近年來，隨著研究的進(jìn)一步深入，有越來越多的模型用于研究。第19頁/共29頁HumanU-87-RFPgliomagrowinginbrainofnudemouse.Whole-bodyimage.Braincancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationGreenFluorescentProteinexpressionRedFluorescentProteinexpression第20頁/共29頁Orthotopictransplantationofintacttissue

Metastaticsites

lymphnodes

liver

lung

skeleton

Estrogen-dependent

Estrogen-independent

GreenFluorescentProteinexpression

RedFluorescentProteinexpressionMX-1-GFPand–RFPbreastcarcinomagrowingonmammaryfatpadsofSCIDmouse.Whole-bodyimage.Breastcancermodels

Features第21頁/共29頁HumanLOX-1-GFPmelanomametastasizedtolung(A),lympnode(B),bone(C)andadrenalgland(D)ofnudemouse.Melanomamodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

lung

skeleton

brain

kidney

adrenalglands第22頁/共29頁Lungcancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

contralaterallung

kidney

skeleton

esophagus

diaphragm

brain

heartSmall-CellCarcinoma

Non-SmallCellCarcinoma

Adenocarcinoma

GreenFluorescentProteinexpression第23頁/共29頁P(yáng)C-3humancarcinomagrowingonprostateandmetastasizedtonumerouslymphnodesofnudemouse.Whole-bodyimage.Prostatecancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

liver

lung

skeletonGreenFluorescentProteinexpressionRedFluorescentProteinexpression第24頁/共29頁NUGC-4-GFPhumanstomachtumorinnudemouse.Primarytumor-redarrow,lymphnodemetastases-whitearrowsStomachcancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

liver

lung

pancreas

adrenalgland

kidney

peritoneumGreenFluorescentProteinexpression第25頁/共29頁Skull(a)andrib(b)metastasesofPC-3-GFPhumanprostatecarcinomagrowingorthotopicallyinnudemouse.SkeletalmetastasisofB16-GFPmousemelanomainnudemouseSkeletalmetastasesofH460